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《包涵體的純化和復(fù)性總結(jié)__最全的前人經(jīng)驗》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、word格式文檔<包涵體的純化和復(fù)性總結(jié)二、包涵體的洗滌?1、包涵體的洗滌問題?通常的洗滌方法一般是洗不干凈的，我以前是這么做的，先把包涵體用6M鹽酸胍溶解充分，過濾除去未溶解的物質(zhì)，注意留樣跑電泳，然后用水稀釋到4M,離心把沉淀和上清分別跑電泳，如此類推可以一直稀釋到合適的濃度，你可以找到一個合適去除雜質(zhì)的辦法，其實這就是梯度沉淀的方法，我覺得比通常的直接洗脫效果好。?包涵體一般難溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑電泳對比，因為有時候難溶解的就是你的目標蛋白，所以每次處理都要把上清和沉淀跑電泳對比，免得把
2、目標蛋白弄丟了。此外剛處理完的包涵體好溶解。冷凍后難溶解，溶解也需要長點時間，也需要大量的溶劑。如果說是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。?2、如何得到比較純的包涵體?對于包涵體的純化，包涵體的前處理是很重要的。包涵體中主要含有重組蛋白,但也含有一些細菌成分,如一些外膜蛋白、質(zhì)粒ＤＮＡ和其它雜質(zhì)。洗滌常用1%以下的中性去垢劑，如Tween、Triton、Lubel和?NP40等加EDTA和還原劑2-巰基蘇糖醇（DTT）、β-巰基乙醇等反復(fù)多次進行，因去垢劑洗滌能力隨溶液離子強度升高而加強，在洗滌包涵體時可加5
3、0?mM?NaCL。這樣提取的包涵體純度至少可達50%以上，而且可保持元結(jié)構(gòu)。也可用低濃度的鹽酸胍或尿素/中性去垢劑/EDTA/還原劑等洗去包涵體表面吸附的大部分不溶性雜蛋白。洗滌液pH以與工程菌生理條件相近為宜，使用的還原劑為0.1-5mM。EDTA為0.1-0.3?mM。去垢劑如Triton?X-100、脫氧膽酸鹽和低濃度的變性劑如尿素充分洗滌去除雜質(zhì),這一步很重要,因為大腸桿菌外膜蛋白Omp?T(37?KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵體的溶解和復(fù)性過程中可導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)的降解。?對
4、于尿素和鹽酸胍的選擇：尿素和鹽酸胍屬中強度變性劑，易經(jīng)透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強的可逆性變性作用，所需濃度尿素8-10M，鹽酸胍6-8M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70-90%，尿素在作用時間較長或溫度較高時會裂解形成氰酸鹽，對重組蛋白質(zhì)的氨基進行共價修飾，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質(zhì)復(fù)性后除去不會造成大量蛋白質(zhì)沉淀以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優(yōu)點，故目前已被廣泛采用。鹽酸胍溶解能力達95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質(zhì)的共價修飾。但它也有成本高、在酸性條
5、件下易產(chǎn)生沉淀、復(fù)性后除去可能造成大量蛋白質(zhì)沉淀和對蛋白質(zhì)離子交換色譜有干擾等缺點。?包涵體最后的純化，一般是離子交換，疏水，或者是親和層析，親和層析尤其是金屬螯合層析用得比較廣泛，而純化的效果也不錯，通常是一步就能達到純度為95%以上的包涵體。?8M高濃度尿素溶解后離心獲得的包涵體溶解液，放在4度冰箱過夜后出現(xiàn)沉淀，專業(yè)整理word格式文檔這種現(xiàn)象我也在實驗中遇到過;開始感覺很奇怪，后來發(fā)現(xiàn)是我們的冰箱的溫控出了問題實驗三、關(guān)于包涵體的溶解：1、?請教GST包涵體溶解?<<<<2、包涵體的溶解十二烷基肌氨酸鈉與
6、十二烷基肌氨酸在溶解包涵體時，可不可以互相代替？可以替換，調(diào)pH不久沒什么區(qū)別了嗎；兩者的功能團相同，pH不同，前者鈉鹽便于保存罷了3、有關(guān)包涵體的溶解問題?強的變性劑如尿素（6-8M）、鹽酸胍（GdnHCl?6M），是通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展，一般來講，鹽酸胍優(yōu)于尿素，因為鹽酸胍是較尿素強的變性劑，它能使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解的異氰酸鹽能導(dǎo)致多肽鏈的自由氨基甲酰化，特別是在堿性pH值下長期保溫時。SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物、Sarkosy
7、l等是去垢劑，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，也可溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。另外，對于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵。還需加入還原劑，如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇（DTT）、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸。對于目標蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。4、8M尿素溶解的包涵體溶液應(yīng)如何保存??我在4度放了半個月，目前沒出什么問題?5、8M尿素溶解的包涵體溶液在室溫下可以放多久而不出現(xiàn)問題?BI溶液在室溫放置48小時，可
8、能會對目的蛋白有影響，因為尿素在堿性條件下可使一些氨基酸酰基化，因而早些處理BI溶液比較好。具體有什么影響我也不是很清楚。做完裂解之后加Triton X－100輕搖３０min，蛋白溶解的會多些<<<<四、包涵體的復(fù)性1、包涵體如何復(fù)性包涵體的復(fù)性主要有兩種方式：1，稀釋溶液，但是操作的液體量大，蛋白稀釋2，透析，超濾或電滲透析去除變性劑其中透析很適合實驗室應(yīng)用，但是時間長
