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《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范浙江省基因診斷中心浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院尚世強(qiáng)一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置及其各室的功能二、各階段操作要求三、PCR污染與對(duì)策四、因操作欠規(guī)范導(dǎo)致的問題分析一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的 規(guī)范化設(shè)置及其各室的功能規(guī)范化設(shè)置：要求參照《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號(hào)文）附件《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》。1.四個(gè)隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專用的儀器設(shè)備。2.明確的標(biāo)記，如加樣器或試劑等。3.單一方向順序，從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)
2、、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)（簡(jiǎn)稱擴(kuò)增區(qū)）至產(chǎn)物分析區(qū)。4.使用不同顏色或有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服。5.實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)至擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。6.各自的清潔用具。各室功能：（一）試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)功能：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。含反應(yīng)混合液的離心管或試管在冰凍前都應(yīng)快速離心數(shù)秒。戴手套。工作結(jié)束后必須立即對(duì)工作區(qū)進(jìn)行清潔。實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面，使用可移動(dòng)紫外燈（254nm波長(zhǎng)）照射，一般照射過夜。實(shí)驗(yàn)室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。（二）標(biāo)本制備區(qū)功能：臨床
3、標(biāo)本的保存，核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA的合成。要正確使用加樣器。正壓條件避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測(cè)核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對(duì)具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。用過的加樣器吸頭必須放入專門的消毒容器內(nèi)。用于RNA擴(kuò)增檢測(cè)的樣本制備好以后，應(yīng)立即進(jìn)行cDNA合成。（三）擴(kuò)增區(qū)功能：DNA或cDNA擴(kuò)增。已制備的DNA模板和合成的cDNA的加入和主反應(yīng)混合液制備成反應(yīng)混合液等也可在
4、本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測(cè)定中，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行?？山档捅緟^(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。如有加樣則應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。打開反應(yīng)管前快速離心數(shù)秒。（四）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)功能：擴(kuò)增片段的測(cè)定。膜上微孔板上探針雜交方法、Southern轉(zhuǎn)移、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、核酸測(cè)序方法等。本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源。溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等有毒或致癌物質(zhì)，注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。負(fù)壓條件。二、各階段操作要求測(cè)定分析前的標(biāo)本采集處理、測(cè)定中的核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及測(cè)定后的結(jié)果
5、報(bào)告等。（一）標(biāo)本的采集臨床標(biāo)本包括EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因肝素是Taq酶的強(qiáng)抑制劑。玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理，250°烘烤4小時(shí)以上可使RNA酶永久性失活。臨床用于RNA（如HCVRNA）擴(kuò)增檢測(cè)的血標(biāo)本應(yīng)盡快（3小時(shí)以內(nèi)）分離血漿，以避免RNA的降解。（二）標(biāo)本的穩(wěn)定化處理DNA：不需特殊穩(wěn)定化處理。RNA：異硫氰酸胍鹽（GITC）可使DNA酶和RNA酶失活。（三）標(biāo)本的運(yùn)送可在常溫下通過郵寄
6、運(yùn)送，如用于DNA擴(kuò)增檢測(cè)的EDTA抗凝全血及用于RNA擴(kuò)增檢測(cè)的GITC穩(wěn)定化處理的標(biāo)本。未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運(yùn)送。（四）標(biāo)本的貯存1.血清/血漿等—-70℃2.用于DNA測(cè)定的已純化核酸樣本—4℃3.用于RNA測(cè)定的已純化核酸樣本—-80℃4.用乙醇沉淀的核酸樣本—-20℃5.GITC處理的RNA標(biāo)本在室溫可保存7天（五）標(biāo)本的處理（核酸提取）抑制物可能來(lái)源于：標(biāo)本本身（如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物）。核酸提取過程中殘留的有機(jī)溶劑（如酚、氯仿等）。痰須液化處理。操作時(shí)（加裂解液
7、后充分混勻，沸水?。┳⒁猓孩匐x心管不能插得過低，以防進(jìn)水；②水浴時(shí)不能加蓋，防管蓋爆開；③水浴時(shí)間須準(zhǔn)確，10±1min；④水浴時(shí)不能走開；⑤左右手分開，左手只接觸樣本，右手只接觸加樣器及操作儀器。（六）靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和擴(kuò)增有多種因素可引起核酸擴(kuò)增檢測(cè)假陰性結(jié)果，如擴(kuò)增靶核酸中抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對(duì)、Mg++濃度不佳、患者標(biāo)本或試劑受污染等。擴(kuò)增儀孔中熱傳導(dǎo)的均一性極為重要。RT-PCR操作注意：①標(biāo)本必須新鮮；②做RNA標(biāo)本的槍頭離心管必須無(wú)菌；③冰上操作；④處理完后須立即
8、上機(jī)，不能放置；⑤注意左右手分開。（七）擴(kuò)增產(chǎn)物的分析擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)定有各種方法，如電泳、限制性酶切、斑點(diǎn)印跡、探針雜交、測(cè)序、分光光度法定量等。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在熒光定量PCR基礎(chǔ)上實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR全過程，最后通過曲線進(jìn)行定量分析。與一般熒光定量PCR使用熒光強(qiáng)度定量不同，實(shí)時(shí)熒光PCR一般使用Ct（每個(gè)反應(yīng)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定域值所經(jīng)的循環(huán)數(shù)）定量，Ct與模板初始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。實(shí)時(shí)熒光PCR的優(yōu)點(diǎn)：精密度高，重復(fù)性能好。TaqMan熒光定量PCR原理探針兩端分
