【精品】臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范

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1、臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范為使基因擴增檢驗技術(shù)有效地應(yīng)用于臨床，更好地為疾病的預(yù)防、診斷和治療服務(wù)，保證檢驗質(zhì)量，特制定本規(guī)范。臨床基因擴增檢驗實驗室的規(guī)范化設(shè)置及其管理臨床基因擴增檢驗實驗室的規(guī)范化設(shè)置詳見《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號文）附件《臨床基因擴増檢驗實驗室基本設(shè)置標準》。為避免污染，必須嚴格遵循《臨床基因擴增檢驗實驗室設(shè)置標準》設(shè)置臨床基因擴增檢驗實驗室。臨床基因擴增檢驗實驗宗四個隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專用的儀器設(shè)備。各區(qū)域都必須有明確的

2、標記，以避免設(shè)備物詁如加樣器或試劑等從其各口的區(qū)域內(nèi)移出從而造成不同的工作區(qū)域間設(shè)備物晶發(fā)生混淆。進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴-增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)（簡稱擴增區(qū)）至產(chǎn)物分析區(qū),避免發(fā)生交叉污染。在不同的工作區(qū)域應(yīng)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標志的工作服，以便于鑒別。此外，當工作者離開工作區(qū)時，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。清潔方法不當也是污染發(fā)生的一個主要原因，因此實驗室的清潔應(yīng)按試劑貯存和準備區(qū)至擴增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進行。不同的實驗區(qū)域應(yīng)有具各

3、自的清潔用具以防止交叉污染。（一）試劑貯存和準備區(qū)下述操作在該區(qū)進行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。貯存試劑和用于標本制備的材料應(yīng)直接運送至試劑貯存和準備區(qū)，不能經(jīng)過產(chǎn)物分析區(qū)。在打開含有反應(yīng)混合液的離心管或試管前，應(yīng)將其快速離心數(shù)秒。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。當貯存試劑溶液經(jīng)檢查可用后，應(yīng)將其分裝貯存?zhèn)溆?，避免由于?jīng)常打開反應(yīng)管吸液而造成污染。含反應(yīng)混合液的離心管或試管在冰凍前都應(yīng)快速離心數(shù)秒。大多數(shù)用于擴增的試劑都應(yīng)冰凍貯存。為避免因單次反應(yīng)

4、取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應(yīng)分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據(jù)通常在實驗室內(nèi)一次測定所需的擴增反應(yīng)數(shù)來決定。主反應(yīng)混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩(wěn)定性通過預(yù)試驗來檢查，評價結(jié)果必須有書面報告。對于”熱啟動”技術(shù)（在第一個高溫變性步驟后加入酶），聚合酶也可不包含在主反應(yīng)混合液屮。在整個本區(qū)的實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施。嚴禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓處理。工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進行清潔。木工作

5、區(qū)的實驗臺表面應(yīng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學物質(zhì)的消毒清潔作用。實驗臺表面的紫外照射應(yīng)方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動紫外燈（254nm波長），在工作完成后調(diào)至實驗臺上60-90cm內(nèi)照射。由于擴增產(chǎn)物僅幾百bp,對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴增片段必須延長照射時間，最好是照射過夜。實驗室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。（二）標本制備區(qū)下述操作在該區(qū)進行：臨床標木的保存，核酸（RNA、DNA）提取、貯存及具加入至擴增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成。要正確

6、使用加樣器。由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動?？赏ㄟ^在木區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件避免從鄰近區(qū)進入木區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣木間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。用過的加樣器吸頭必須放入專門的消毒（例如含次氯酸鈉溶液）容器內(nèi)。實驗室桌椅表面侮次工作厲都要清潔，實驗材料（原始血標本、血清標本、提取中的標本與試劑的混合液等）如出現(xiàn)外濺，則必須分別處理并作出記錄。對實驗臺適當?shù)淖贤庹丈洌?

7、54nm波長，與工作臺面近距離）適合于滅活去污染?？梢苿幼贤饩€管燈可用來確保工作后對實驗臺面的充分照射。樣木處理對核酸擴增有很人影響，必須使用有效的核酸提取方法，可在開展臨床標本檢測前對提取方法進行評價。用于RNA擴增檢測的樣本制備好以后，應(yīng)立即進行cDNA合成，因為cDNA鏈較RNA穩(wěn)定，保存相對容易。為保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的需要，應(yīng)在標本制備區(qū)設(shè)置一個以上的溫育裝置。cDNA合成的理想溫度依所使用的酶而定，傾向于使用一步法：即使用在擴增反應(yīng)緩沖液條件下具有逆轉(zhuǎn)錄活性的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進行逆轉(zhuǎn)錄，

8、其較cDNA合成后再開蓋以調(diào)節(jié)緩沖液或加入聚合酶進行擴增發(fā)生污染的可能性降低。待測RNA的cDNA拷貝須保存在標本制備區(qū)，不得在本區(qū)對樣本進行PCR擴增。卜謎工作在本區(qū)內(nèi)進行：DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA（來自樣木制備區(qū)）的加入和主反應(yīng)混合液（來自試劑貯存和制備區(qū)）制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。在巢式PCR測定中，通常在第一?輪擴增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行。不能從本區(qū)再進入任何”上游”區(qū)域，