dna的提取的原理和方法

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1、DNA的提取的原理和方法為了研究DNA分子在生命代謝中的作用，常常需要從不同的生物材料中提取DNA.由于DNA分子在生物體內(nèi)的分布及含量不同，要選擇適當(dāng)?shù)牟牧咸崛NA。*動(dòng)植物中，小牛胸腺?動(dòng)物肝臟?魚類精子，植物種子的胚中都含有豐富的DNA。*微生物中，谷氨酸菌體含7%~10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大腸肝菌含9%~10%。*從各種材料中提取DNA方法不同，分離提取的難易程度也不同。*對(duì)于低等生物。如從病毒中提取DNA比較容易，多數(shù)病毒DNA分子量較小，提取時(shí)易保持其結(jié)構(gòu)完整性。*從細(xì)菌及高等動(dòng)植物中提取DNA難度大一些。細(xì)菌DNA分子量較大，一般達(dá)2×10道爾頓

2、。因此易被機(jī)械張力剪斷。細(xì)菌DNA，除核DNA外，還有質(zhì)粒DNA等。?1、???核酸的理化性質(zhì)A.RNA和核苷酸的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。除肌苷酸、鳥苷酸具有鮮味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。??B.DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g/L。DNA在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。C.天然狀態(tài)的DNA是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細(xì)胞核中。要從細(xì)胞中提取DNA時(shí)，先把D

3、NP抽提出來，再把P除去，再除去細(xì)胞中的糖，RNA及無機(jī)離子等，從中分離DNA。??2.細(xì)胞的破碎細(xì)菌有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，首先要破碎經(jīng)胞。方法有三種：???????①機(jī)械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；???????②化學(xué)試劑法：用SDS處理細(xì)胞；??????③酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，都可使細(xì)胞壁破碎。由于高等動(dòng)物DNA主要存在于細(xì)胞核與線粒體中，所以提取時(shí)有兩個(gè)困難（高等植物與此類似）：??????①破碎細(xì)胞難；從處死動(dòng)物?分離組織器宮到破碎細(xì)胞費(fèi)時(shí)長(zhǎng)。在此時(shí)期間DNA可能會(huì)被DNase降解，而動(dòng)物組織：特別是肌肉組織很難破碎,即使是較易破碎的肝?腎等組織也往往使用組織勻

4、漿器，易造成DNA斷裂。?????②分子量大，一般比細(xì)菌的大2—3個(gè)數(shù)量級(jí)，比病毒的大4—5個(gè)數(shù)量。對(duì)不同生物材料，要根據(jù)具體情況選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x提取方法。3.DNA提取的幾種方法(1).濃鹽法A.利用RNA和DNA在電解溶液中溶解度不同，將二者分離，常用的方法是用1M氯納提取化鈉抽提,得到的DNP粘液與含有少量辛醇的氯仿一起搖蕩,使乳化,再離心除去蛋白質(zhì),此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA位于上層水相中,用2倍體積95%乙醇可將DNA鈉鹽沉淀出來.B.也可用0.15MNaCL液反復(fù)洗滌細(xì)胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脫氧核糖蛋白,再按氯仿---異醇法除去蛋

5、白.　　兩種方法比較,后種方法使核酸降解可能少一些.C.以稀鹽酸溶液提取DNA時(shí),加入適量去污劑,如SDS可有助于蛋白質(zhì)與DNA的分離。在提取過程中為抑制組織中的DNase對(duì)DNA的降解作用,在氯化鈉溶液中加入檸檬酸鈉作為金屬離子的烙合劑.通常用.15MNaCL,0.015M檸檬鈉,并稱SSC溶液,提取DNA.（2）.陰離子去污劑法:???????用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性,可以直接從生物材料中提取DNA.由于細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,因?yàn)殛庪x子去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵,所以常用陰離子去污劑提取DNA.（3）.苯酚抽提法:???????苯酚作

6、為蛋白變性劑,同時(shí)抑制了DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時(shí),由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA。此時(shí)DNA是十分粘稠的物質(zhì)，可用玻璃漫漫繞成一團(tuán)，取出。此法的特點(diǎn)是使提取的DNA保持天然狀態(tài).（4）.水抽提法:??????????利用核酸溶解于水的性質(zhì),將組織細(xì)胞破碎后,用低鹽溶液除去RNA，然后將沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,離心后收集上清液.在上清中加入固體氯化鈉調(diào)節(jié)至2.6M.加入2倍體積

7、95%乙醇,立即用攪拌法攪出.然后分別用66%?80%和95%乙醇以及丙銅洗滌,最后在空氣中干燥,既得DNA樣品.此法提取的DNA中蛋白質(zhì)含量較高,故一般不用.為除蛋白可將此法加以改良,在提取過程中加入SDS.