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《螢光素酶報告基因技術(shù)》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、ReportSmartly－螢光素酶報告基因技術(shù)自然界的螢光發(fā)光海星發(fā)光甲殼蟲發(fā)光真菌發(fā)光節(jié)蟲自然界的螢光發(fā)光魚發(fā)光甲蟲自然界的螢光螢火蟲報告基因的作用細胞信號轉(zhuǎn)導途徑啟動子/增強子受體結(jié)合病毒/細胞相互作用轉(zhuǎn)錄因子藥物誘導作用或”效果”熒光-Fluorescence螢光-LuminescenceFireWormLuminescencevs.Fluorescence螢光（Bioluminescence）熒光（Fluorescence）是化學發(fā)光（Chemilumi-nescence）的一種，激發(fā)能量來
2、自化學反應吸收來自光源的光，再發(fā)射另一光子螢光發(fā)光計（Luminometer）熒光計（Fluorometer）液閃儀（ScintilationCounter）電荷耦合裝置光學成像系統(tǒng)（CCDopiticalimagingsystem）熒光顯微鏡各種報告基因的優(yōu)點和缺點報告基因優(yōu)點缺點螢光素酶優(yōu)越的靈敏度高信號值無內(nèi)源活性需要底物?-gal靈敏度好細菌，血清等內(nèi)源活性高需要底物GUS（葡糖醛酸糖苷酶）靈敏度好植物中內(nèi)源活性低90%的E.coli,人／動物細胞中有內(nèi)源活性酶的擴散可引起“過度報告”需要底物
3、SEAP（分泌性堿性磷酸酶）分泌性報告基因(不需裂解)在HeLa,癌和其它細胞類型中有高的內(nèi)源活性需要底物CAT（氯霉素轉(zhuǎn)乙?；福?真核細胞沒有背景表達-易于使用-設備現(xiàn)成(液閃儀,層析)放射性的靈敏度底50ｈ半衰期GFP（綠色熒光蛋白）顯微鏡:亞細胞定位不需底物背景可能高折疊“情形”可導致信號差別螢光素酶報告基因的主要優(yōu)點非放射性檢測快（比CAT等）靈敏度高（可比CAT檢測靈敏度高100倍）半衰期短（在理想條件下，可檢測到10-20摩爾的螢光素酶分子。在哺乳動物細胞中半衰期3小時，在植物細胞中半衰
4、期3.5小時。而CAT在哺乳動物細胞中的半衰期約50小時）線形范圍廣（在10-16M(10pg/L)至10-8M(1mg/L)范圍內(nèi),光強度與螢光素酶濃度成正比）一般比顯微鏡檢測的熒光更靈敏(對多孔板而言)生物螢光比熒光更穩(wěn)定,因為自然界進化的酶能保護光子發(fā)射器通過基因工程可以延伸生物螢光的性能和能力螢光素酶報告基因的使用原理:制備含有l(wèi)uc/Rluc的DNA轉(zhuǎn)染提供刺激測量螢光調(diào)節(jié)序列Luc２在活細胞中做報告基因檢測外界刺激(導引物)螢光素酶基因蛋白質(zhì)折疊調(diào)節(jié)序列加工轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄因子信號轉(zhuǎn)導翻譯反義RN
5、A受體蛋白-蛋白相互作用RNA酶病毒感染和增殖RNAi抑制啟動子/增強子分析“碰撞啟動子”:全序列:2)逐步缺失:Promoterluc+LightPromoterluc+LightPromoterluc+FireflyandRenilla螢火蟲生物螢光的化學螢光素+ATP+O2螢光素酶Oxyluciferin+AMP+PPi+CO2+Light螢光素酶:單體,61,000Daltons輔-底物:ATP.Mg2+螢光素:Mg2+海腎螢光素酶反應Coelenterazine+O2螢光素酶Coelente
6、ramide+CO2+Light螢光素酶:單體,36,000Daltons螢光素:(Coelenterazine)EnzymestructuresFireflyRenilla為什么要使用雙報告基因報告基因A(首要信號)報告基因B(第二信號)特異生物學反饋+非特異生物學反饋非特異生物學反饋檢測結(jié)果比較首要與第二信號確定特異生物學反饋細胞可能有內(nèi)源脫乙?；?-Gal或GUS活性.CAT,?-Gal和GUS檢測是終點檢測.不能同時對在一個管中組合了螢光素酶和CAT,或?-Gal,的兩個報告基因的檢測都靈敏
7、而快速．傳統(tǒng)的雙報告基因的缺點雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)比用CAT和?-Gal做內(nèi)對照的優(yōu)點速度樣品不需預處理，不需孵育。兩次檢測在幾秒種內(nèi)完成靈敏兩個螢光素酶的線性范圍超過7個酶濃度數(shù)量級。內(nèi)源螢光素酶背景極低方便一管完成檢測，樣品不必分份實驗質(zhì)粒對照質(zhì)粒用海腎螢光素酶作對照歸一實驗變化歸一反應=對照的（海腎螢光素酶)實驗的(螢火蟲螢光素酶)螢火蟲螢光素酶海腎螢光素酶用兩個螢光素酶做報告基因（螢火蟲+海腎）數(shù)據(jù)處理舉例第一天 螢光素酶活性(RLU)比率歸一的活性樣品處理重復ＦＲ（F:R)變化倍數(shù)對
8、照１5,1282,511２7,5533,815３10,5555,4137,7453,9131.981.00處理Ａ１5,13764,467２40,7123,57488,7877,6546,02925,23211.525.82處理B1587,6355,144988,3478,8323409,8813,564661,9545,847113.2157.18第二天對照１15,52920,4330.76２21,89730,8410.7110,76013,6200.7
