雙螢光素酶報(bào)告基因技術(shù)

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1、雙螢光素酶報(bào)告基因技術(shù)的應(yīng)用戴吉芮博士技術(shù)服務(wù)代表Promega北京辦事處自然界的螢光發(fā)光真菌發(fā)光節(jié)蟲發(fā)光海星發(fā)光甲殼蟲自然界的螢光發(fā)光魚發(fā)光甲蟲自然界的螢光螢火蟲報(bào)告基因的作用?細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑?啟動(dòng)子/增強(qiáng)子?受體結(jié)合?病毒/細(xì)胞相互作用?轉(zhuǎn)錄因子?藥物誘導(dǎo)作用或”效果”各種報(bào)告基因的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)報(bào)告基因優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)螢光素酶?優(yōu)越的靈敏度?需要底物–高信號(hào)值–無內(nèi)源活性?-gal?靈敏度好?細(xì)菌，血清等內(nèi)源活性高?需要底物GUS（葡糖醛酸糖?靈敏度好?90%的E.coli,人／動(dòng)物細(xì)胞中苷酶）?植物中內(nèi)源活性低有內(nèi)源活性?酶的擴(kuò)散可引起“過度報(bào)告”?需要底物SEAP（分泌性堿?分泌性報(bào)告基

2、因(不需裂?在HeLa,癌和其它細(xì)胞類型性磷酸酶）解)中有高的內(nèi)源活性?需要底物CAT（氯霉素轉(zhuǎn)乙-真核細(xì)胞沒有背景表達(dá)?放射性的?；福?易于使用?靈敏度底-設(shè)備現(xiàn)成(液閃儀,層析)?50ｈ半衰期GFP（綠色熒光蛋?顯微鏡:亞細(xì)胞定位?背景可能高白）?不需底物?折疊“情形”可導(dǎo)致信號(hào)差別螢光素酶報(bào)告基因的主要優(yōu)點(diǎn)?非放射性。?檢測(cè)快（比CAT等）。?靈敏度高（可比CAT檢測(cè)靈敏度高100倍）。?半衰期短。（在理想條件下，可檢測(cè)到10-20摩爾的螢光素酶分子。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中半衰期3小時(shí)，在植物細(xì)胞中半衰期3.5小時(shí)。而CAT在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的半衰期約50小時(shí)）。?線形范圍廣。（在10-

3、16M(10pg/L)至10-8M(1mg/L)范圍內(nèi),光強(qiáng)度與螢光素酶濃度成正比）。?一般比顯微鏡檢測(cè)的熒光更靈敏(對(duì)多孔板而言)。?生物螢光比熒光更穩(wěn)定,因?yàn)樽匀唤邕M(jìn)化的酶能保護(hù)光子發(fā)射器。?通過基因工程可以延伸生物螢光的性能和能力。螢光素酶報(bào)告基因的使用?原理:–制備含有l(wèi)uc/Rluc的DNA調(diào)節(jié)序列Luc２–轉(zhuǎn)染–提供刺激–測(cè)量螢光在活細(xì)胞中做報(bào)告基因檢測(cè)外界刺激(導(dǎo)引物)受體蛋白-蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相互作用轉(zhuǎn)錄因子病毒感染調(diào)節(jié)序列RNAi抑制和增殖螢光素酶基因轉(zhuǎn)錄加工RNA酶翻譯蛋白質(zhì)折疊反義RNA啟動(dòng)子/增強(qiáng)子分析?“碰撞啟動(dòng)子”:Light1)全序列:Promoterluc+2

4、)逐步缺失:LightPromoterluc+Promoterluc+FireflyandRenilla螢火蟲生物螢光的化學(xué)螢光素酶螢光素Oxyluciferin+AMP+ATP+OMg2++PP+CO+Light2i2螢光素酶:單體,61,000Daltons輔-底物:ATP.Mg2+螢光素:海腎螢光素酶反應(yīng)螢光素酶CoelenterazineCoelenteramide+O+CO+Light22螢光素酶:單體,36,000Daltons螢光素:(Coelenterazine)EnzymestructuresFireflyRenilla為什么要使用雙報(bào)告基因報(bào)告基因A(首要信號(hào))報(bào)告基

5、因B(第二信號(hào))特異生物學(xué)反饋+非特異生物學(xué)反饋非特異生物學(xué)反饋檢測(cè)結(jié)果比較首要與第二信號(hào)確定特異生物學(xué)反饋傳統(tǒng)的雙報(bào)告基因的缺點(diǎn)?細(xì)胞可能有內(nèi)源脫乙?；甫?Gal或GUS活性.?CAT,β-Gal和GUS檢測(cè)是終點(diǎn)檢測(cè).?不能同時(shí)對(duì)在一個(gè)管中組合了螢光素酶和CAT,或β-Gal,的兩個(gè)報(bào)告基因的檢測(cè)都靈敏而快速．雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)比用CAT和?-Gal做內(nèi)對(duì)照的優(yōu)點(diǎn)?速度–樣品不需預(yù)處理，不需孵育。兩次檢測(cè)在幾秒種內(nèi)完成?靈敏–兩個(gè)螢光素酶的線性范圍超過7個(gè)酶濃度數(shù)量級(jí)。內(nèi)源螢光素酶背景極低?方便–一管完成檢測(cè)，樣品不必分份用兩個(gè)螢光素酶做報(bào)告基因（螢火蟲+海腎）實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒螢火蟲螢

6、光素酶對(duì)照質(zhì)粒海腎螢光素酶用海腎螢光素酶作對(duì)照歸一實(shí)驗(yàn)變化實(shí)驗(yàn)的(螢火蟲螢光素酶)歸一反應(yīng)=對(duì)照的（海腎螢光素酶)數(shù)據(jù)處理舉例第一天螢光素酶活性(RLU)比率歸一的活性樣品處理重復(fù)ＦＲ（F:R)變化倍數(shù)對(duì)照１5,1282,511２7,5533,815３10,5555,4137,7453,9131.981.00處理Ａ１5,13764,467２40,7123,574３88,7877,654Δ活性倍數(shù)6,02925,23211.525.82處理B(F/R)樣品1587,6355,1442988,3478,832=F/R)對(duì)照3409,8813,564661,9545,847113.2157.1

7、8第二天對(duì)照１15,52920,4330.76第二天處理Ｃ計(jì)算如下：２21,89730,8410.71?10,76013,6200.7916,06221,6310.741.00處理Ｃ１850,23920,843Δ活性倍數(shù)２578,95114,830(791,021/19,154)３943,87321,788=（16,062/21,631)791,02119,15441,3055,81處理D114,86519,3-0528,96712