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1、第11章基因治療GeneTherapyp498本章內(nèi)容提示基因治療(genetherapy)體細(xì)胞基因治療、生殖細(xì)胞基因治療基因轉(zhuǎn)移方法靶細(xì)胞特點(diǎn)、靶細(xì)胞種類反義寡核苷酸技術(shù)自殺基因與旁觀者效應(yīng)基因治療(Genetherapy)基因治療(Genetherapy):指應(yīng)用DNA重組技術(shù),將外源正?;?qū)氚屑?xì)胞,以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病,以達(dá)到治療的目的。為達(dá)到這一目的,實(shí)施相應(yīng)的策略。一、基因治療策略策略:直接基因治療和間接基因治療1、直接基因治療:糾正突變基因在原位修復(fù)缺陷的基因,
2、以達(dá)到治療目的。為較理想的基因治療策略,由于存在某些問題,目前正在努力之中。(未實(shí)現(xiàn))2、間接療法:以正常的基因替代致病基因。導(dǎo)入外源正常基因,代替有缺陷的基因。而對(duì)靶細(xì)胞而言,沒有去除或修復(fù)有缺陷的基因。用DNA重組技術(shù)設(shè)法修復(fù)患者細(xì)胞中有缺陷的基因,使細(xì)胞恢復(fù)正常功能而達(dá)到治療遺傳病的目的。途徑:就基因轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞不同,基因治療有兩種途徑:1、生殖細(xì)胞基因治療2、體細(xì)胞基因治療1、生殖細(xì)胞基因治療將正?;蜣D(zhuǎn)移到患者生殖細(xì)胞(精細(xì)胞,卵細(xì)胞,早期胚胎)使其發(fā)育成正常個(gè)體。為理想的治療方法,從
3、根本上治療遺傳病,使其有害基因不能在人群中散播。但還存在某些問題:1)靶細(xì)胞的遺傳修飾至今尚無實(shí)質(zhì)性進(jìn)展;2)基因轉(zhuǎn)移效率不高,只能用顯微注射方法;3)只適用于排卵周期短而次數(shù)多的動(dòng)物,很難適用于人類。(但目前輔助生殖技術(shù)的發(fā)展較為有效的解決了獲取卵細(xì)胞的辦法。一次可獲取少者3-5個(gè),多者十幾個(gè)。)2.體細(xì)胞基因治療somaticcellgenetherapy將正常基因轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞,使之表達(dá)基因產(chǎn)物,以達(dá)到治療的目的。但有害基因能遺傳給后代。措施:(1)正?;蜣D(zhuǎn)移至體外培養(yǎng)的體細(xì)胞,有效表達(dá)后,
4、再回輸?shù)襟w內(nèi)。(2)正?;?qū)氚屑?xì)胞,定位整合到染色體上,準(zhǔn)確的替換異常基因,是理想的措施。(3)隨機(jī)整合,非特定座位,只要有效的表達(dá)即可達(dá)到治療的目的。(4)體細(xì)胞基因治療理論上不必矯正所有的體細(xì)胞。存在的問題對(duì)特定座位基因轉(zhuǎn)移,目前還存在較大困難;隨機(jī)插入可能引起后代的基因突變。二、基因治療的方法基因治療的關(guān)鍵性步驟----目的基因的獲得與轉(zhuǎn)移基因治療首先獲得目的基因通常從基因組中分離基因克隆↓定位↓表達(dá)↓評(píng)價(jià)表達(dá)情況一)目的基因的獲得—正常基因的分離與克隆二)外源基因的轉(zhuǎn)移通過不同方法,將
5、目的基因轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞。1)物理方法(1)電穿孔法(electroporotion)將細(xì)胞置于高壓脈沖電場(chǎng)中,通過電壓使細(xì)胞產(chǎn)生可逆性的穿孔。周圍基質(zhì)中的DNA可滲進(jìn)細(xì)胞,進(jìn)而表達(dá)。瞬間細(xì)胞細(xì)胞膜核膜通透性增加高壓脈沖DNA滲入細(xì)胞(2)顯微注射法(microinjection)利用顯微操作把目的基因直接注入靶細(xì)胞或細(xì)胞核例:轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備重組基因DNA微注射(體外)小鼠受精卵回植假妊娠仔鼠動(dòng)物模型:轉(zhuǎn)基因鼠(每個(gè)鼠細(xì)胞中都含有外源基因,按孟德爾方式遺傳)clonesheepDolly體細(xì)胞提取
6、核重組細(xì)胞回植Dolly卵細(xì)胞去核細(xì)胞(3)微粒子轟擊法利用亞微粒的鎢和金能吸附DNA,并將其包裹起來形成微粒,通過物理途徑獲得高速度,微粒瞬間既可進(jìn)入靶細(xì)胞,達(dá)到轉(zhuǎn)移目的基因的目的,而不損傷靶細(xì)胞。該方法可使目的基因在皮膚、肝、胰、胃及乳腺等細(xì)胞中表達(dá)。2)化學(xué)法磷酸鈣沉淀法:目的基因與磷酸鈣等物質(zhì)混合,形成沉淀的DNA微細(xì)顆粒,易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),并整合到受體細(xì)胞基因組中,在適當(dāng)條件下得以表達(dá)。磷酸鈣+DNA→混合微細(xì)顆粒↓沉淀反應(yīng)20~30min↓細(xì)胞在沉淀物中暴露5~24h方法簡(jiǎn)單,但
7、轉(zhuǎn)化效率低。3)脂質(zhì)體法(liposome)應(yīng)用人工制備的類似細(xì)胞膜的膜性結(jié)構(gòu)——脂質(zhì)體,包裝外源基因,再與靶細(xì)胞融合,外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞,使其表達(dá)。DNA細(xì)胞融合轉(zhuǎn)化細(xì)胞PEG仙苔病毒DNA脂膜4)同源重組法同源重組(homologusrecombination):外源基因和染色體上的基因在同源序列間發(fā)生重組而插入染色體。是將外源基因定位導(dǎo)入細(xì)胞的染色體上。單交換雙交換通過同源重組定點(diǎn)插入珠蛋白基因XbaIBstXIXbaIδβ△βneoXbaIBstXIδΔββneo正常基因座位帶有珠蛋白基
8、因的質(zhì)粒C重組后,插入外源基因片段帶有——neo基因(新霉素抗性基因),重組后的細(xì)胞在含有neo的培養(yǎng)基中生長(zhǎng),沒有插入新基因的細(xì)胞死亡,將有重組的細(xì)胞篩選出來。5)病毒介導(dǎo)基因內(nèi)轉(zhuǎn)移(Viralmediatedtransfer)是通過病毒為載體(vector),將外源基因通過重組技術(shù)與病毒重組,然后去感染受體細(xì)胞感染細(xì)胞重組病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA)常用的病毒載體DNA病毒1)逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)目前應(yīng)用最多、最成功.病毒感染細(xì)胞后,其基因組RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈DN