基因治療genetherapy

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1、第11章基因治療GeneTherapyp498本章內(nèi)容提示基因治療(genetherapy)體細(xì)胞基因治療、生殖細(xì)胞基因治療基因轉(zhuǎn)移方法靶細(xì)胞特點(diǎn)、靶細(xì)胞種類反義寡核苷酸技術(shù)自殺基因與旁觀者效應(yīng)基因治療（Genetherapy）基因治療（Genetherapy）：指應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病,以達(dá)到治療的目的。為達(dá)到這一目的，實(shí)施相應(yīng)的策略。一、基因治療策略策略：直接基因治療和間接基因治療1、直接基因治療：糾正突變基因在原位修復(fù)缺陷的基因，

2、以達(dá)到治療目的。為較理想的基因治療策略，由于存在某些問題，目前正在努力之中。（未實(shí)現(xiàn)）2、間接療法：以正常的基因替代致病基因。導(dǎo)入外源正常基因，代替有缺陷的基因。而對(duì)靶細(xì)胞而言，沒有去除或修復(fù)有缺陷的基因。用DNA重組技術(shù)設(shè)法修復(fù)患者細(xì)胞中有缺陷的基因，使細(xì)胞恢復(fù)正常功能而達(dá)到治療遺傳病的目的。途徑:就基因轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞不同，基因治療有兩種途徑：1、生殖細(xì)胞基因治療2、體細(xì)胞基因治療1、生殖細(xì)胞基因治療將正?；蜣D(zhuǎn)移到患者生殖細(xì)胞（精細(xì)胞，卵細(xì)胞，早期胚胎）使其發(fā)育成正常個(gè)體。為理想的治療方法，從

3、根本上治療遺傳病，使其有害基因不能在人群中散播。但還存在某些問題：1）靶細(xì)胞的遺傳修飾至今尚無實(shí)質(zhì)性進(jìn)展；2）基因轉(zhuǎn)移效率不高，只能用顯微注射方法；3）只適用于排卵周期短而次數(shù)多的動(dòng)物，很難適用于人類。（但目前輔助生殖技術(shù)的發(fā)展較為有效的解決了獲取卵細(xì)胞的辦法。一次可獲取少者3-5個(gè)，多者十幾個(gè)。）2．體細(xì)胞基因治療somaticcellgenetherapy將正常基因轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞，使之表達(dá)基因產(chǎn)物，以達(dá)到治療的目的。但有害基因能遺傳給后代。措施：（1）正?；蜣D(zhuǎn)移至體外培養(yǎng)的體細(xì)胞，有效表達(dá)后，

4、再回輸?shù)襟w內(nèi)。（2）正?；?qū)氚屑?xì)胞，定位整合到染色體上，準(zhǔn)確的替換異常基因，是理想的措施。（3）隨機(jī)整合，非特定座位，只要有效的表達(dá)即可達(dá)到治療的目的。（4）體細(xì)胞基因治療理論上不必矯正所有的體細(xì)胞。存在的問題對(duì)特定座位基因轉(zhuǎn)移，目前還存在較大困難；隨機(jī)插入可能引起后代的基因突變。二、基因治療的方法基因治療的關(guān)鍵性步驟----目的基因的獲得與轉(zhuǎn)移基因治療首先獲得目的基因通常從基因組中分離基因克隆↓定位↓表達(dá)↓評(píng)價(jià)表達(dá)情況一）目的基因的獲得—正常基因的分離與克隆二）外源基因的轉(zhuǎn)移通過不同方法，將

5、目的基因轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞。1）物理方法（1）電穿孔法（electroporotion）將細(xì)胞置于高壓脈沖電場(chǎng)中，通過電壓使細(xì)胞產(chǎn)生可逆性的穿孔。周圍基質(zhì)中的DNA可滲進(jìn)細(xì)胞，進(jìn)而表達(dá)。瞬間細(xì)胞細(xì)胞膜核膜通透性增加高壓脈沖DNA滲入細(xì)胞（2）顯微注射法（microinjection）利用顯微操作把目的基因直接注入靶細(xì)胞或細(xì)胞核例：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備重組基因DNA微注射（體外）小鼠受精卵回植假妊娠仔鼠動(dòng)物模型：轉(zhuǎn)基因鼠(每個(gè)鼠細(xì)胞中都含有外源基因，按孟德爾方式遺傳)clonesheepDolly體細(xì)胞提取

6、核重組細(xì)胞回植Dolly卵細(xì)胞去核細(xì)胞（3）微粒子轟擊法利用亞微粒的鎢和金能吸附DNA，并將其包裹起來形成微粒，通過物理途徑獲得高速度，微粒瞬間既可進(jìn)入靶細(xì)胞，達(dá)到轉(zhuǎn)移目的基因的目的，而不損傷靶細(xì)胞。該方法可使目的基因在皮膚、肝、胰、胃及乳腺等細(xì)胞中表達(dá)。2）化學(xué)法磷酸鈣沉淀法：目的基因與磷酸鈣等物質(zhì)混合，形成沉淀的DNA微細(xì)顆粒，易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并整合到受體細(xì)胞基因組中，在適當(dāng)條件下得以表達(dá)。磷酸鈣+DNA→混合微細(xì)顆粒↓沉淀反應(yīng)20~30min↓細(xì)胞在沉淀物中暴露5~24h方法簡(jiǎn)單，但

7、轉(zhuǎn)化效率低。3）脂質(zhì)體法（liposome）應(yīng)用人工制備的類似細(xì)胞膜的膜性結(jié)構(gòu)——脂質(zhì)體，包裝外源基因，再與靶細(xì)胞融合，外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞，使其表達(dá)。DNA細(xì)胞融合轉(zhuǎn)化細(xì)胞PEG仙苔病毒DNA脂膜4）同源重組法同源重組（homologusrecombination）:外源基因和染色體上的基因在同源序列間發(fā)生重組而插入染色體。是將外源基因定位導(dǎo)入細(xì)胞的染色體上。單交換雙交換通過同源重組定點(diǎn)插入珠蛋白基因XbaIBstXIXbaIδβ△βneoXbaIBstXIδΔββneo正常基因座位帶有珠蛋白基

8、因的質(zhì)粒C重組后，插入外源基因片段帶有——neo基因（新霉素抗性基因），重組后的細(xì)胞在含有neo的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，沒有插入新基因的細(xì)胞死亡，將有重組的細(xì)胞篩選出來。5）病毒介導(dǎo)基因內(nèi)轉(zhuǎn)移（Viralmediatedtransfer）是通過病毒為載體（vector），將外源基因通過重組技術(shù)與病毒重組，然后去感染受體細(xì)胞感染細(xì)胞重組病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA)常用的病毒載體DNA病毒1)逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）目前應(yīng)用最多、最成功.病毒感染細(xì)胞后，其基因組RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈DN