基因治療1215

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1、1.請(qǐng)說(shuō)明基因治療中的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題是什么？1.答：基因治療中的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題是基因轉(zhuǎn)移。自從80年代中期逆轉(zhuǎn)錄病毒載體面世以來(lái)，遺傳病的基因治療獲得了一次飛躍性進(jìn)展,至9（）年代初用該載體第一次治療了腺首酸脫氨^（adeninenucleotidedeaminase,ADA）缺乏引起的嚴(yán)重免疫缺陷綜合癥患者山。自從那次歷史性的治療示，基因治療迅速擴(kuò)展到其他遺傳病、癌癥、AIDS、心血管疾病等?；蛑委煹闹魉２襟E包括冃的基因的克隆、基因轉(zhuǎn)移、靶細(xì)胞的選擇和臨床試驗(yàn)觀察等,其中基因轉(zhuǎn)移是基因治療的關(guān)鍵步驟。棊因轉(zhuǎn)移方法口J分為直接體內(nèi)法（

2、invivo）和間接體內(nèi)法（exvivo）o基因轉(zhuǎn)移技術(shù)按載休乂可分為四人類：病毒載體法、非病毒性牛物載體法、非生物性載體法和非載體法。然而，基因轉(zhuǎn)移作為基因治療的關(guān)鍵技術(shù)，在將基因有效地轉(zhuǎn)移到足夠多的靶細(xì)胞，并使細(xì)胞表達(dá)這些基因等方面存在不少問(wèn)題。美國(guó)國(guó)家人類基因組研究中心主任FrancisCollins認(rèn)為,Fl前便用的載體及轉(zhuǎn)移技術(shù)小還沒(méi)有一種能用于臨床并永久有效的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)⑵。卜?面介紹兒種基因轉(zhuǎn)移技術(shù)：一.直接休內(nèi)法直接體內(nèi)法是將基因直接導(dǎo)入體內(nèi)的各種體細(xì)胞中。直接體內(nèi)法包括以下方法：①非載體法：質(zhì)粒DNA注射，氣霧劑吸

3、入，體內(nèi)電穿孔；②非生物性載體法：脂質(zhì)體，微粒子，基因活化基質(zhì)；③非病毒性生物載體法：配體，基因工程疫苗；④病毒載體法：重組病毒載體局部臟器注射、吸入，病毒活疫苗口服。這些方法操作方便，可反復(fù)使用，病人易于接受，但存在外源基因?qū)Π屑?xì)胞的轉(zhuǎn)染率低，整合較少見(jiàn)，表達(dá)往往是暫吋的。此外，各導(dǎo)入方法還存在一些有待解決的問(wèn)題：1）質(zhì)粒DNA直接肌肉注射。肌肉注射簡(jiǎn)單易行，但注入的DNA往往未整合入染色體中,游離于染色體之外，不能復(fù)制，表達(dá)時(shí)間太短。2）氣霧劑吸入。質(zhì)粒DNA或脂質(zhì)體屮的DNA可通過(guò)氣霧劑導(dǎo)入呼吸道上皮細(xì)胞，帶有外源基因的腺病壽

4、載體也可導(dǎo)入呼吸道上皮細(xì)胞⑵。3）體內(nèi)電穿孔術(shù)。先皮下注射質(zhì)粒DNA,然后在表皮和真皮之間加一脈沖電場(chǎng)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，這種方法的轉(zhuǎn)移效率較低⑶。4）脂質(zhì)體體內(nèi)轉(zhuǎn)染法。脂質(zhì)體可以包裹DNA,然后它被組織細(xì)胞攝入而轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞⑷。非病毒載體基因轉(zhuǎn)移的第一個(gè)臨床試驗(yàn)?zāi)耸菍蠨NA的脂質(zhì)體注入腫瘤中以表達(dá)界體組織的移植抗原。但脂質(zhì)體體內(nèi)轉(zhuǎn)染較難將DNA導(dǎo)入某些靶細(xì)胞，如肝細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞機(jī)械阻擋肝細(xì)胞與血流中的脂質(zhì)體相接觸。5）基因槍微粒子轟擊法。采用高壓電極使包被質(zhì)粒DNA的金、鴨微粒子高速穿入靶組織或細(xì)胞，從而轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞⑸。6）基因活化基

5、質(zhì)（geneactivatedmedium,GAM）技術(shù)。某些牛.物可降解的基質(zhì)稱作活化基質(zhì)，如可生物降解的陶瓷、不銹鋼或鈦等。1996年9刀美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室興辦的基因治療會(huì)議上，有人報(bào)告將浸漬外源基因的活化基質(zhì)涂于骨折處或傷口，當(dāng)修補(bǔ)細(xì)胞長(zhǎng)入GAM時(shí)，攝収外源基因，表達(dá)可促進(jìn)愈合的蛋白質(zhì)⑹。7）配體一受體介導(dǎo)法。將質(zhì)粒DNA與某種多肽性配體結(jié)合，多肽配體再被細(xì)胞膜上的受體識(shí)別并結(jié)合，從而通過(guò)吞噬作用將DNA導(dǎo)向特定的靶細(xì)胞。若將DNA在體內(nèi)運(yùn)送至肝,可以先將DNA和能與肝細(xì)胞受體特異性結(jié)合的去唾液酸糖蛋口偶聯(lián)起來(lái)以便通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞過(guò)

6、程而被攝入，這樣,DNA大部分被肝細(xì)胞所攝?。?】。該法的缺點(diǎn)是內(nèi)吞水泡易被溶酶體破壞，且其表達(dá)只是暫時(shí)的。8）重組外源基因的病毒載體的局部或臟器直接注射⑻。該法存在的主要問(wèn)題是人血清屮的補(bǔ)體成分與病毒載體結(jié)合而火活病毒載體。二、間接體內(nèi)法先從病人身上取得靶細(xì)胞，將外源基因在體外轉(zhuǎn)染病人靶細(xì)胞后，再將轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞輸冋病人體內(nèi)的方法即間接體內(nèi)法。間接體內(nèi)法包括以下方法：①非載體法：體外電穿孔，顯微注射，共沉淀，同源重組；②非生物性載體法：脂質(zhì)體，微粒子；③非病毒性牛物載休法：線粒體，哺乳動(dòng)物人工染色體(mammalianartific

7、ialchromosome,MAC),人類人I.染色體(humanartifi2cialchromosome,HAC),人類天然小染色體(humanmicrochromosome,HMC);④病毒載體法：逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus,RV)、腺病^{(adenovirus,AV)、單純皰疹病毒(herpessimplexvirus,HSV)、EB病毒(EBV)、人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)、痘病毒、昆蟲(chóng)病克等。其中，非載體間接體內(nèi)法的各種方法介紹如下：1)體外電穿孔法。利用脈沖

8、電場(chǎng)在細(xì)胞膜上瞬間形成微小孔而將DNA導(dǎo)入細(xì)胞。電穿孔法導(dǎo)入的DNA拷貝數(shù)很侑限，大多數(shù)為單拷貝，通過(guò)雙選擇劑選擇，可提高轉(zhuǎn)染細(xì)胞的拷貝數(shù)。此外，電穿孔法的細(xì)胞死亡率亦較高⑼。2)顯微注射法。顯微注射法將DNA直接注入細(xì)胞核，避免了胞