基因治療1215

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1、1.請說明基因治療中的關鍵技術問題是什么？1.答：基因治療中的關鍵技術問題是基因轉移。自從80年代中期逆轉錄病毒載體面世以來，遺傳病的基因治療獲得了一次飛躍性進展,至9（）年代初用該載體第一次治療了腺首酸脫氨^（adeninenucleotidedeaminase,ADA）缺乏引起的嚴重免疫缺陷綜合癥患者山。自從那次歷史性的治療示，基因治療迅速擴展到其他遺傳病、癌癥、AIDS、心血管疾病等?；蛑委煹闹魉２襟E包括冃的基因的克隆、基因轉移、靶細胞的選擇和臨床試驗觀察等,其中基因轉移是基因治療的關鍵步驟。棊因轉移方法口J分為直接體內法（

2、invivo）和間接體內法（exvivo）o基因轉移技術按載休乂可分為四人類：病毒載體法、非病毒性牛物載體法、非生物性載體法和非載體法。然而，基因轉移作為基因治療的關鍵技術，在將基因有效地轉移到足夠多的靶細胞，并使細胞表達這些基因等方面存在不少問題。美國國家人類基因組研究中心主任FrancisCollins認為,Fl前便用的載體及轉移技術小還沒有一種能用于臨床并永久有效的基因轉移技術⑵。卜?面介紹兒種基因轉移技術：一.直接休內法直接體內法是將基因直接導入體內的各種體細胞中。直接體內法包括以下方法：①非載體法：質粒DNA注射，氣霧劑吸

3、入，體內電穿孔；②非生物性載體法：脂質體，微粒子，基因活化基質；③非病毒性生物載體法：配體，基因工程疫苗；④病毒載體法：重組病毒載體局部臟器注射、吸入，病毒活疫苗口服。這些方法操作方便，可反復使用，病人易于接受，但存在外源基因對靶細胞的轉染率低，整合較少見，表達往往是暫吋的。此外，各導入方法還存在一些有待解決的問題：1）質粒DNA直接肌肉注射。肌肉注射簡單易行，但注入的DNA往往未整合入染色體中,游離于染色體之外，不能復制，表達時間太短。2）氣霧劑吸入。質粒DNA或脂質體屮的DNA可通過氣霧劑導入呼吸道上皮細胞，帶有外源基因的腺病壽

4、載體也可導入呼吸道上皮細胞⑵。3）體內電穿孔術。先皮下注射質粒DNA,然后在表皮和真皮之間加一脈沖電場進行基因轉移，這種方法的轉移效率較低⑶。4）脂質體體內轉染法。脂質體可以包裹DNA,然后它被組織細胞攝入而轉染靶細胞⑷。非病毒載體基因轉移的第一個臨床試驗乃是將包裹有DNA的脂質體注入腫瘤中以表達界體組織的移植抗原。但脂質體體內轉染較難將DNA導入某些靶細胞，如肝細胞，內皮細胞機械阻擋肝細胞與血流中的脂質體相接觸。5）基因槍微粒子轟擊法。采用高壓電極使包被質粒DNA的金、鴨微粒子高速穿入靶組織或細胞，從而轉染靶細胞⑸。6）基因活化基

5、質（geneactivatedmedium,GAM）技術。某些牛.物可降解的基質稱作活化基質，如可生物降解的陶瓷、不銹鋼或鈦等。1996年9刀美國冷泉港實驗室興辦的基因治療會議上，有人報告將浸漬外源基因的活化基質涂于骨折處或傷口，當修補細胞長入GAM時，攝収外源基因，表達可促進愈合的蛋白質⑹。7）配體一受體介導法。將質粒DNA與某種多肽性配體結合，多肽配體再被細胞膜上的受體識別并結合，從而通過吞噬作用將DNA導向特定的靶細胞。若將DNA在體內運送至肝,可以先將DNA和能與肝細胞受體特異性結合的去唾液酸糖蛋口偶聯(lián)起來以便通過細胞內吞過

6、程而被攝入，這樣,DNA大部分被肝細胞所攝?。?】。該法的缺點是內吞水泡易被溶酶體破壞，且其表達只是暫時的。8）重組外源基因的病毒載體的局部或臟器直接注射⑻。該法存在的主要問題是人血清屮的補體成分與病毒載體結合而火活病毒載體。二、間接體內法先從病人身上取得靶細胞，將外源基因在體外轉染病人靶細胞后，再將轉染的靶細胞輸冋病人體內的方法即間接體內法。間接體內法包括以下方法：①非載體法：體外電穿孔，顯微注射，共沉淀，同源重組；②非生物性載體法：脂質體，微粒子；③非病毒性牛物載休法：線粒體，哺乳動物人工染色體(mammalianartific

7、ialchromosome,MAC),人類人I.染色體(humanartifi2cialchromosome,HAC),人類天然小染色體(humanmicrochromosome,HMC);④病毒載體法：逆轉錄病毒(retrovirus,RV)、腺病^{(adenovirus,AV)、單純皰疹病毒(herpessimplexvirus,HSV)、EB病毒(EBV)、人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)、痘病毒、昆蟲病克等。其中，非載體間接體內法的各種方法介紹如下：1)體外電穿孔法。利用脈沖

8、電場在細胞膜上瞬間形成微小孔而將DNA導入細胞。電穿孔法導入的DNA拷貝數很侑限，大多數為單拷貝，通過雙選擇劑選擇，可提高轉染細胞的拷貝數。此外，電穿孔法的細胞死亡率亦較高⑼。2)顯微注射法。顯微注射法將DNA直接注入細胞核，避免了胞