豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬瘟病毒混合感染的診斷與防制分析

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豬繁殖與呼吸綜合征、圓環(huán)病毒2型和豬瘟病毒的混合感染的診斷與防制分析夏偉1、2李鵬1危艷武3張宇輝2羅玉均2馮春復(fù)21、黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)黑龍江大慶1633192、哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司黑龍江哈爾濱1500013、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所豬傳染病研究室哈爾濱150001摘要:2011年12月，南方某大型豬場(chǎng)爆發(fā)以母豬流產(chǎn)，死胎，弱仔，哺乳期仔豬發(fā)生體溫升高，皮膚發(fā)紺，呼吸衰竭，頑固性腹瀉；保育仔豬發(fā)燒，聚堆，皮膚紅，昏睡，腹股溝淋巴結(jié)腫大為主要癥狀的疾病，死淘率高。剖殺3頭發(fā)病哺乳仔豬，3頭死亡保育豬取淋巴結(jié)、脾、肺臟病變組織用PCR，RT-PCR方法分別檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒，圓環(huán)病毒2型，豬瘟野毒為陽(yáng)性，結(jié)合本病的臨床癥狀和病理剖檢確診為豬繁殖與呼吸綜合征，圓環(huán)病毒2型，豬瘟的混合感染。關(guān)鍵詞:豬繁殖與呼吸綜合征病毒；圓環(huán)病毒2型；豬瘟病毒；混合感染；診斷豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是世界范圍內(nèi)一種重要的豬傳染病,1996年哈爾濱獸醫(yī)研究所郭寶清首次證實(shí)我國(guó)有PRRS存在[1]，并從繁殖障礙豬群分離到PRRSV[2]。近幾年對(duì)我國(guó)發(fā)病豬群的血清檢測(cè)結(jié)果表明，該病現(xiàn)已存在于我國(guó)大部分地區(qū)[3]，并且呈暴發(fā)式流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。特別自2006年“豬高熱病”流行后，據(jù)有關(guān)研究表明，豬繁殖與呼吸綜合征變異毒株是由普通豬繁殖與呼吸綜合征病毒的NSP2段基因發(fā)生了缺失變異而來(lái)，其臨床癥狀主要是出現(xiàn)“三高一低”即高熱（40℃以上）、高發(fā)病率、高死亡率、低治愈率；豬群出現(xiàn)皮膚發(fā)紅，個(gè)別有神經(jīng)癥狀，能導(dǎo)致母豬流產(chǎn)甚至死亡，給養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展帶來(lái)重創(chuàng)。豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)感染已經(jīng)是威脅當(dāng)前世界養(yǎng)豬業(yè)的一個(gè)重要疾病，1991年P(guān)MWS首次在加拿大被發(fā)現(xiàn)，目前已證實(shí)呈世界性流行。PCV2感染引起的相關(guān)疾病在我國(guó)的流行情況也十分嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4,5]。我國(guó)學(xué)者在我國(guó)許多地方都分離出了這種病毒,且和其他病毒混合感染的情況日益明顯，PCV-2感染病例在臨床上經(jīng)?？梢?jiàn)。豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種高致死性、烈性傳染病。近幾年隨著我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,豬瘟的發(fā)生出現(xiàn)一些新特點(diǎn),表現(xiàn)為發(fā)病年齡小、散發(fā)流行、混合感染以及非典型性或隱性等特點(diǎn)[6]，這又給本病的防治帶來(lái)了很大的困難。生產(chǎn)實(shí)踐中，PRRSV、PCV-2混合感染[7]，PRRSV、CSFV混合感染[8]，CSFV、PCV2混合感染[9]最為常見(jiàn)。本試驗(yàn)應(yīng)用PCR，RT-CR方法結(jié)合臨床癥狀和病理剖檢對(duì)上海某豬場(chǎng)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV），圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV2)，豬瘟病毒（CSFV）混合感染進(jìn)行了確診,從而為豬場(chǎng)防制本病，制定合理的免疫程序提供科學(xué)依據(jù)。1材料與方法1.1　病料來(lái)源　來(lái)自上海某豬場(chǎng)的6份發(fā)病豬和死亡豬的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等臟器，編號(hào)，3、4、5號(hào)為哺乳仔豬，6、7、8號(hào)為保育仔豬。冷凍運(yùn)送，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2酶和其他試劑　PCR擴(kuò)增試劑盒、飽和酚、TaqDNA聚合酶、dNTPs、EB、DEPC、提取總RNA用TRIzol,BioFlux公司產(chǎn)品，Cycle-PureKit,OMEGA公司產(chǎn)品。DL2000Marker，TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0購(gòu)自大連寶生物有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純?cè)噭?.3　引物設(shè)計(jì)及合成根據(jù)GenBank上發(fā)表的PRRSV基因序列(AY032626;AY262352),用Oli-go6.0軟件設(shè)計(jì)引物， 上游引物5′-AGAACTGTGACAACAACGCTG-3′，下游引物：5′-GAGTCGATGATGGCTTGAGCT-3′，擴(kuò)增缺失株（高致病性PRRSV毒株）和非缺失株（經(jīng)典PRRSV毒株）預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別約263bp和350bp。由寶生物工程(大連)有限公司合成。根據(jù)已發(fā)表的PCV-2核酸全序列合成了1對(duì)特異性的PCR引物。上游引物:5′-CAGCAAGAAGAATGGAAGAAGCGGA-3′:下游引物:5′-CCAGGACTACAATATCCGTGTAACT-3′。擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)為1057bp，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。參考GenBank中公布的豬瘟病毒（CSFV），石門(mén)（shimen）株基因組，設(shè)計(jì)合成了1對(duì)CSFV特異性的引物Csfv-F：5ˊ-AAGTAACAGAGACATGAATGG-3ˊCsfv-R：5ˊ-CCAAAAGGATAGGTAGGGT-3ˊ由寶生物工程(大連)有限公司合成。1.4　病料處理及DNA的提取將組織樣品稱(chēng)量、研磨，制成勻漿后反復(fù)凍融3次，取上清液按照常規(guī)方法提取樣品總DNA參照文獻(xiàn)[10]1.5　RNA的提取及cDNA合成參照文獻(xiàn)[11]1.6　PRRSV—RT-PCR反應(yīng)　按下列組成配制PCR反應(yīng)體系25μL：RnaseFreeddH2O10.5μL，MgCL2(25mmol/L)5μL，dNTPMixture：2.5μL，10×OneStepRNAPCRbuffer2.5μL，引物(20pmol/μL)F29230.5μL、R32720.5μL，AMVReverseTranscriptaseXL0.5μL，AMV-OptimizedTaq0.5μL，RanseInhibitor0.5μL，模板2μL。反應(yīng)條件為：50℃30min，94℃2min。94℃30s，58℃30s，72℃45s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延長(zhǎng)10min。1.7　PCV-2—PCR反應(yīng)按下列組成配制PCR反應(yīng)液：10×PCRBuffer1.5μL，ddH2O10.4μL，MgCL2(25mmol/L)1.5μL，dNTPs(10mmol/L)0.3μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，上下游引物(20μmol/L)各0.3μL，DNA模板0.5μL；共15μL。將上述反應(yīng)液加入到PCR反應(yīng)管中，輕輕混勻。PCR反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃30s、55℃30s、72℃45s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。1.8CSFV—RT-PCR反應(yīng)按下列組成配制PCR反應(yīng)液：10×PCRBuffer1.5μL，ddH2O10.4μL，MgCL2(25mmol/L)1.5μL，dNTPs(10mmol/L)0.3μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，上下游引物(20μmol/L)各0.3μL，cDNA模板0.5μL；共15μL。將上述反應(yīng)液加入到PCR反應(yīng)管中，輕輕混勻。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性12min；然后94℃45s、55℃45s、72℃1min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。1.9PCR產(chǎn)物鑒定　用1%瓊脂糖凝膠電泳,紫外檢測(cè)儀下觀察結(jié)果，以PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)以PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)263bp，1057bp，602bp條帶的樣品為陽(yáng)性。 2防制措施2.1　對(duì)發(fā)病較重的豬及時(shí)淘汰，病死豬深埋處理。流產(chǎn)母豬，同窩發(fā)病仔豬進(jìn)行隔離飼養(yǎng)觀察。圈舍及用具徹底消毒。2.2　對(duì)全群未發(fā)病豬用哈獸研牌豬瘟兔化弱毒疫苗（4000RID/頭份）進(jìn)行緊急免疫接種，劑量為2頭份/頭（配種至妊娠85天母豬不免）。2.3　豬瘟疫苗免疫7天后全群未發(fā)病豬實(shí)施哈獸研牌豬藍(lán)耳病弱毒疫苗（CH-1R株）緊急免疫接種，保育豬2頭份，育肥豬、后備豬3頭份，種公、母豬3頭份（妊娠80天后重胎母豬不免）。待疫情穩(wěn)定后 ，種母豬配種后40天免疫藍(lán)耳病滅活疫苗4毫升/次，間隔21天再肌注一次。種公豬一年2次，每次肌注4毫升。另外定期監(jiān)測(cè)公豬精液藍(lán)耳病野毒感染情況，野毒感染的公豬及早淘汰。2.4　用哈獸研牌豬瘟兔化弱毒疫苗（4000RID/頭）對(duì)初生仔豬實(shí)施超前免疫，劑量為0.5頭份/頭，50日齡進(jìn)行第二次免疫2頭份。2.5　全群種公、母豬，商品豬接種哈獸研牌豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（LG株）2毫升，哺乳仔豬14日齡免疫2毫升，疫情穩(wěn)定后14日齡免疫1毫升，35日齡1毫升。2.6　經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷后，對(duì)該場(chǎng)除采取常規(guī)隔離、消毒、抗繼發(fā)感染，提高飼料營(yíng)養(yǎng)等綜合防制措施外，對(duì)未發(fā)病豬群進(jìn)行豬瘟疫苗，藍(lán)耳病弱毒疫苗及圓環(huán)病毒2型疫苗緊急免疫接種，使疫情很快得到緩解。3討論與分析3.1　根據(jù)該場(chǎng)臨床癥狀，病理剖檢，PCR及RT-PCR技術(shù)最后確診為PRRSV，PCV2，CSFV混合感染。調(diào)查其發(fā)病原因，我們發(fā)現(xiàn)本場(chǎng)2011年11月1日之前豬群生產(chǎn)一直穩(wěn)定，但是豬場(chǎng)分別在2011年9月下旬，10月下旬從外場(chǎng)引進(jìn)體重平均100斤左右的后備豬106頭，未經(jīng)隔離直接與本場(chǎng)后備豬混群飼養(yǎng)。外引后備豬最先發(fā)病，本場(chǎng)后備豬后發(fā)病從體重150斤以上的開(kāi)始蔓延到初產(chǎn)母豬，而本次疫情初產(chǎn)母豬流產(chǎn)比例很高，可能是疫情發(fā)生的原因。3.2　本場(chǎng)過(guò)去幾年后備豬配種前一直沒(méi)有進(jìn)行過(guò)藍(lán)耳病疫苗的免疫，也沒(méi)有采取其他預(yù)防措施，配過(guò)種的后備豬抗體是否轉(zhuǎn)陽(yáng)不清楚。是否獲得堅(jiān)實(shí)免疫保護(hù)不得而知。后備豬與外引豬，后備豬與經(jīng)產(chǎn)母豬等不同豬群混群恰恰增加PRRSV交叉感染的機(jī)會(huì)。如果母豬接種疫苗前就存在PRRSV持續(xù)感染，病毒血癥。再使用藍(lán)耳弱毒疫苗采用“一刀切免疫”，就會(huì)增加母豬發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)，最近幾年關(guān)于給妊娠后期母豬接種藍(lán)耳病活疫苗導(dǎo)致豬群發(fā)病的病例屢見(jiàn)不鮮。所以筆者建議待豬群穩(wěn)定后給種豬群接種藍(lán)耳病滅活疫苗，更安全，3-4周齡健康仔豬接種藍(lán)耳病活疫苗，可有效降低仔豬水平感染發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。3.3檢測(cè)6頭仔豬中，3頭哺乳仔豬日齡均在10日齡以內(nèi)。檢測(cè)出PRRSV可見(jiàn)母豬經(jīng)過(guò)胎盤(pán)垂直感染的可能性最大。經(jīng)胎盤(pán)垂直感染新生仔豬，導(dǎo)致新生仔豬肺臟，脾臟等器官受損嚴(yán)重[12]。所以要高度重視豬場(chǎng)種豬群選留和免疫。3.4臨床上出現(xiàn)一定比例哺乳仔豬、保育仔豬肌肉震顫，并伴有一定比例死亡，活下來(lái)的豬到保育階段仍有肌肉震顫現(xiàn)象，經(jīng)過(guò)診斷為豬瘟野毒感染（2/6)，本場(chǎng)盡管免疫了豬瘟疫苗但出現(xiàn)免疫失敗，筆者認(rèn)為可能有兩個(gè)原因：一是本場(chǎng)是藍(lán)耳病，圓環(huán)病毒陽(yáng)性場(chǎng)，PRRSV，PCV2持續(xù)感染，造成豬免疫抑制，影響疫苗效果。二是本場(chǎng)一直采用豬瘟普免的方式來(lái)免疫疫苗，一年3次免疫，如果不定期監(jiān)測(cè)豬瘟抗體水平，依靠經(jīng)驗(yàn)無(wú)法判斷豬群的免疫水平。3.5從本場(chǎng)檢測(cè)結(jié)果（3/6)，PCV2感染陽(yáng)性率相當(dāng)高，特別是保育仔豬階段最嚴(yán)重，說(shuō)明這個(gè)病毒在豬群中普遍存在和流行。帶毒豬長(zhǎng)期排毒，威脅其他豬的健康，單一感染豬缺乏典型的臨床癥狀與病理變化，與PRRSV共同感染能引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)消耗性綜合征，表現(xiàn)為淋巴組織腫大、出血，肉芽腫性炎癥，壞死性肝炎，仔豬消瘦、生長(zhǎng)緩慢等特征性病變；混合感染能加重PRRSV對(duì)仔豬引起的間質(zhì)性肺炎的嚴(yán)重程度[13]，另外學(xué)者研究表明PCV-2的感染會(huì)對(duì)豬的免疫系統(tǒng)造成損害從而抑制豬瘟疫苗的免疫效果[14]。而應(yīng)用PCV2疫苗是預(yù)防圓環(huán)病毒2型感染，降低免疫抑制的主要手段之一，哈爾濱獸醫(yī)研究所劉長(zhǎng)明[15]對(duì)我國(guó)部分豬場(chǎng)研究表明疫苗接種豬群與空白對(duì)照組對(duì)比，免疫母豬結(jié)果顯示，出生時(shí)死胎率下降了2.3%，初生仔豬成活率提高了7.6%，斷奶時(shí)成活率提高了7.5%，主動(dòng)免疫仔豬，保育階段豬發(fā)病率下降了15.1%，死淘率下降了3.6%。并且豬場(chǎng)藥物保健費(fèi)用明顯下降，提高了飼料轉(zhuǎn)化率。這與疫苗免疫后機(jī)體產(chǎn)生能中和野毒的高水平抗體有關(guān)。4綜上所述： 診斷結(jié)果表明此次疫情確實(shí)由PRRSV感染所致，PCV2和CSFV感染加重了疫情,其主要原因是豬場(chǎng)從外地頻繁引種有關(guān),所以豬場(chǎng)引種過(guò)程要慎重。由于PRRSV抗原具有多樣性,個(gè)體和群體可水平持續(xù)感染,使防治變得較為困難,世界各國(guó)都制定了一些防治措施,主要是防止病毒的侵入和擴(kuò)散,如嚴(yán)禁從疫區(qū)引種、淘汰感染豬群、限制帶毒豬的移動(dòng)等方法。在當(dāng)前,采用全進(jìn)全出的飼養(yǎng)制度,改善飼料營(yíng)養(yǎng)和豬舍環(huán)境,減少豬群應(yīng)激,疫苗合理免疫是預(yù)防該病暴發(fā)的可行辦法。從檢測(cè)結(jié)果看豬場(chǎng)要預(yù)防疫情的再次暴發(fā),豬場(chǎng)必須重視豬藍(lán)耳病、豬瘟和豬圓環(huán)病的預(yù)防和監(jiān)測(cè)[16]。參考文獻(xiàn)[1]郭寶清，陳章水，劉文興，等.應(yīng)用間接免疫熒光法從國(guó)內(nèi)生殖障礙綜合征豬群中檢出生殖與呼吸綜合征病[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，1996,26（3）;3-5.[2]郭寶清，陳章水，劉文興，等.從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J].中國(guó)畜禽傳染病，1996.18（2）:1-4.[3]李華，楊漢春，張曉梅，等.豬血液和淋巴組織中淋巴細(xì)胞亞群表型分布[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2001，(1)：834-838.[4]ChaeC.Areviewofporcinecirovirus2-associatedsyndromesanddiseases[J].JVet,2005,169:326-336.[5]朗洪武，張廣川，吳發(fā)權(quán)，等.斷奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合征血清抗體檢測(cè)[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,2000,30(3):3-5.[6]姚文生，范學(xué)政，王琴，寧宜寶,等.我國(guó)豬瘟流行現(xiàn)狀與防控措施建議[J].中國(guó)獸藥雜志，2011，45(9):44～47，55.[7]李玉峰，王先煒，姜　平，等上海地區(qū)出現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合征和2型豬圓環(huán)病毒混合感染[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，23（5），442-444.[8]朱文豪，王治方，徐引弟，郭小參，張玉楊，等.豬繁殖與呼吸綜合征和豬瘟混合感染的RT-PCR診斷[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2009,36（12）,153-154.[9]陳義祥,黃　夏,劉翠權(quán),胡麗萍,陳芳芳,黃勝斌,何　丹,劉　棋，等.豬瘟病毒與豬圓環(huán)病毒2型混合感染的檢測(cè)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2005,26(9):90-92.[10]范培虎,危艷武,郭龍軍,吳洪麗,黃立平,劉長(zhǎng)明，等.2005年-2010年我國(guó)部分地區(qū)PRRSV流行毒株的遺傳變異分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011,32(3):1-7.[11]李　曦，符　芳，李　媛，王靖飛，崔尚金，童光志，等斷乳仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的病原學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2006,42（9）：21-22.[12]吳東來(lái),郭寶清,李桂芝,蔡雪暉,王繼科,褚桂芳,等豬生殖-呼吸道綜合征病毒抗原在死胎及新生仔豬體內(nèi)的分布[J],1999，21（2），128-129.[13]溫永俊，吳國(guó)軍，蔡雪輝’，劉永剛，王洪峰，姜成剛，尹訓(xùn)南，等，豬圓環(huán)病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染對(duì)仔豬致病性的評(píng)估[J]，中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007,29（5），336-340,393.[14]潘　艷，李　軍，禤雄標(biāo)，陳澤祥，胡　帥，楊　威，謝永平，許力干，謝宇舟，等豬瘟疫苗在豬圓環(huán)病毒2型陽(yáng)性豬場(chǎng)的免疫效果觀察[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010,31(11):23-26.[15]劉長(zhǎng)明，危艷武，陸月華，黃立平，吳洪麗，張朝霞，溫士剛，姜鳳娟,等，豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（LG株）的研制與應(yīng)用[J],畜牧獸醫(yī)科技信息，2010,9,29-30.[16]王　波，張　鵬，楊增岐，張淑霞，黨如意，等陜西省PRRSV與CSFV、PCV2、PRV混合感染的檢測(cè)[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18(5):27-30.作者簡(jiǎn)介：夏偉（1977 ～），男，黑龍江哈爾濱人，碩士，主要從事規(guī)模豬場(chǎng)豬傳染病診斷，防制與新技術(shù)推廣工作。聯(lián)系方式：手機(jī)：18845103383，E-MaiL:xiawei98340032@sohu.com.工作單位：哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司地址：哈爾濱市香坊區(qū)哈平路678號(hào)郵編：150001