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1、ELISA檢測梅毒螺旋體抗體影響因素探討李秋鳴舒永霞(張掖市中心血站甘肅張掖734000)【關(guān)鍵詞】ELISA梅毒螺旋體抗體標(biāo)木【中圖分類號】R446【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】2095-1752(2013)22-0074-02ELISA檢測梅毒螺旋體抗體是1種敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法，但在實(shí)際操作中的影響因素較多，木站自2009年采用ELISA法檢測梅毒螺旋體抗體以來，對試驗(yàn)的影響因素進(jìn)行了分析，現(xiàn)就比較常見的影響因素作一些探討。1標(biāo)木的影響因素1.1外源性因素氈括標(biāo)木溶血、標(biāo)木被細(xì)菌污染、標(biāo)木保存時(shí)間過長、標(biāo)木凝固不全和
2、乳糜血等。標(biāo)木溶血對ELISA的影響主要是反應(yīng)孔對溶血血清中的血紅蛋白的非特異性吸附和溶血時(shí)細(xì)胞內(nèi)液對血清的稀釋作用。Hb具有類過氧化酶活性，其作用與辣根過氧化物酶類似，如果反應(yīng)孔非特異吸附：Hb而殘留，則可催化底物顯色，使木底吸光度值升高甚至造成假陽性。當(dāng)標(biāo)木中抗體濃度與吸光度值呈線性關(guān)系時(shí)才會因溶血的稀釋作用使吸光度值下降；當(dāng)標(biāo)木中抗體濃度近臨界值時(shí)，可能造成假陰性。標(biāo)木的污染菌體可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，可使試驗(yàn)出現(xiàn)非特異性顯色，使結(jié)果出現(xiàn)假陽性。標(biāo)木在冰箱中保存過久，血清中IgG可聚合成多聚體，AFP可形成二聚體，在用間接法測定中
3、會導(dǎo)致木底過深，甚至造成假陽性。冰凍保存的標(biāo)木反復(fù)凍融產(chǎn)生機(jī)械剪切力對標(biāo)木中的蛋白等分子有破壞作用，可引起假陰性結(jié)果。標(biāo)木凝固不全的血清中含有部分纖維蛋白原，如將其加入微孔中，在ELISA測定過程中仍可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易使結(jié)果呈假陽性。乳糜血中的乳糜微粒會吸附于反應(yīng)孔壁，可能造成非特異吸附，致使結(jié)果出現(xiàn)假陽性。1.2內(nèi)源性因素包括類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、高濃度的非特異免疫球蛋白、異嗜性抗體、某些自身抗體等。在類風(fēng)濕患者及正常人血清中，常含有較高或不同濃度的類風(fēng)濕因子(RF),其一般為IgM型，亦有IgG和IgA型，具有與變性IgG產(chǎn)生非
4、特異結(jié)合的特點(diǎn)，因?yàn)樵贓LISA測定中，其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標(biāo)的特異抗體IgG結(jié)合，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。補(bǔ)體在固相酶免疫測定中，來自哺乳動物的固相抗體和酶標(biāo)二抗均有激活人補(bǔ)體系統(tǒng)的功能。一方面，固相抗體和酶標(biāo)二抗可因其吸附及結(jié)合過程中抗體分子發(fā)生變構(gòu)，使Fc段的補(bǔ)體clq結(jié)合點(diǎn)暴露出來，使clq成為1個(gè)中介物將二者交聯(lián)起來出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另一方面，固相抗體也會因?yàn)榛罨a(bǔ)體的結(jié)合，封閉抗體和抗原的表位結(jié)合能力而引起假陰性。人類血清中含有抗嚙齒類動物的免疫球蛋白(lg)的抗體，即天然的異嗜性抗體，異嗜性抗體可通過交聯(lián)固
5、相和酶標(biāo)的單抗或多抗而出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。2試劑的影響因素2.1試劑的選擇B前EUSA檢測梅毒螺旋體抗體試劑盒均采用基因工程方法，TP47和TmpA等包被酶聯(lián)板，由于不同廠家TP抗原組合不同，來源和用量方面也冇差異，造成不同廠家的EUSA檢測梅毒螺旋體抗體試劑盒檢測結(jié)果有很大差異，雖然國家采用批批檢定的形式對EUSA試劑嚴(yán)格把關(guān)，但不冋廠家的試劑在使用效果上仍存在差異。要選擇靈敏度高、特異性強(qiáng)的試劑。2.2試劑的運(yùn)輸、貯存要在低溫(2?8°C)條件下進(jìn)行。因酶類物質(zhì)是1種特殊的蛋白質(zhì)，久置、反復(fù)凍融或受熱后，酶易失去活性，反應(yīng)微孔板條如果一次用不
6、完吋，應(yīng)進(jìn)行密封保存防止受潮，并在短期內(nèi)使用。2.3試劑的準(zhǔn)備在臨床實(shí)驗(yàn)室，對試劑的準(zhǔn)備?-般不太注意，通常的做法是在實(shí)驗(yàn)吋將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法奮可能影響后面吋間不夠的問題，其直接的后果是對一些弱陽性標(biāo)本的檢測出現(xiàn)假陰性。因此，在EUSA測定前試劑的準(zhǔn)備也是很重要的，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20?30min后(或根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況確定平衡吋間)，再進(jìn)行測定，使試劑盒在使用前與室溫平衡，這樣做的0的能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度較快地達(dá)到所需的溫度，以滿足后面的測定需求。2.4試劑的使用不同批號、不同廠家的試劑，由于
7、酶標(biāo)記物中酶的濃度不盡相同，與固相載體上的相應(yīng)抗原或抗體發(fā)生特異性反應(yīng)的程度不同，故不能混合使用。對于超過有效期的試劑則嚴(yán)禁使用。3試驗(yàn)操作中的因素3.1加樣1＞加樣吋間過長，尤其是手工加樣吋間過長，會導(dǎo)致孔間差異加大，更不可先把陰陽性及質(zhì)控血清加好后長吋間等待。2)加酶試劑及樣品吋，要加在孔底，不能加在孔壁上使用滴瓶滴加試劑時(shí)，滴加的角度不冋和擠壓的力度不同，致使滴加的試劑量不準(zhǔn)，都可導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。3.2溫育的影響溫育對于ELISA檢測梅毒螺旋體抗體是最關(guān)鍵的因素，溫育吋間、溫度的選擇一般根據(jù)試劑盒的說明書選擇溫育的時(shí)間、溫度。加完標(biāo)
8、本和(或)試劑后將微孔板從室溫放入水浴箱或溫箱中吋，孔內(nèi)溫度從室溫升至37°C需要一定吋間，如果是將微孔板一放人溫箱即開始計(jì)時(shí)，這樣就容易造成實(shí)際測定中溫育吋間不夠
