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1、酸奶中嗜熱鏈球菌的分離及鑒定生物工程2011酸奶中嗜熱鏈球菌的分離及鑒定采樣環(huán)境:時間:實驗?zāi)康?超市伊利（輝山）酸奶地點：溫度：1、從酸奶中分離培養(yǎng)嗜熱鏈球菌2、對嗜熱鏈球菌進行鑒定實驗原理及意義(1)意義：發(fā)酵乳中有多種發(fā)酵的菌種，其中嗜熱鏈球菌做為制作酸奶的必須原料不僅可以進入小腸的上半部分幫助消化吸收，還可以產(chǎn)生能乳糖酶，幫助乳糖不耐受的人們消化乳糖。同時抑制膽固醇合成酶的活性，降低血清中膽固醇含量，嗜熱鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)控制血壓，有臨床實驗表明含有嗜熱鏈球菌的酸奶可以使血液中的低密度膽固醇降低，而使血纖維蛋白的濃度升高。(2)原理：酸奶中的菌種眾多，如：保
2、加利亞乳桿菌，嗜酸乳桿菌，乳雙歧桿菌，嗜熱鏈球菌等，其中，菌落呈現(xiàn)黃色(或紅色)，顯微鏡觀察為鏈球狀可以確定為嗜熱鏈球菌的疑似菌落，而對大腸桿菌和金色葡萄球菌有抑制作用的就可以確定疑似菌落為確定的嗜熱鏈球菌。嗜熱鏈球菌可于45°C生長。(3)利用BCG牛乳培養(yǎng)基為分離培養(yǎng)基，采用涂布稀釋分離的方法，從酸奶中成功分離出嗜熱乳酸鏈球菌。因在BCG牛乳培養(yǎng)基中有溴甲酚紫(一種酸堿指示劑)，因而其在BCG牛乳培養(yǎng)基上的菌落顏色為黃色，很容易與不產(chǎn)酸的雜菌分開，提高了分離效率。利用該方法分離嗜熱鏈球菌，菌落較大、菌落容易觀察，極大地提高了分離效率.若無溴甲酚紫可用甲基紅或石蕊代替
3、，甲基紅的變色范圍是pH4.4?6.2,紅一黃，石蕊是一種常用的酸堿指示劑，變色范圍是pH=5.0-8.0之間紅一藍。(4)采用常規(guī)的革蘭氏染色、形態(tài)觀察和發(fā)酵產(chǎn)物紙層析實驗相結(jié)合的方法對分離到的菌株進行簡單鑒定，該方法操作簡單、快速、實驗結(jié)果可靠.實驗材料：酸牛奶、酒精燈、接種環(huán)、高壓滅菌鍋、培養(yǎng)皿（10個）、錐形瓶（3個）、顯微鏡、試管（8個）、量筒500ml、滴管，鑷子、接種鏟實驗試劑：革蘭氏染色試劑、無菌水、金色葡萄球菌（或大腸桿菌）、NaCI5g、牛肉膏3g、蛋白胨19gBCG牛乳培養(yǎng)基:（A）溶液脫脂奶粉20g、水100ml、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液0.2m
4、l（或甲基紅、石蕊）、80°C滅菌20min（B）溶液瓊脂4g、酵母膏2g、水100ml、121°C滅菌20min基礎(chǔ)培養(yǎng)基:（大腸桿菌培養(yǎng)）用牛肉膏3g,蛋白膝10g，NaC15g,瓊脂15?20g，水1000ml實驗方法:（1）配制培養(yǎng)基以無菌操作趁熱將（A）（B）溶液混合均勻后倒10個平板（2）培養(yǎng)方式：一般培養(yǎng)法取5ml酸奶樣品加入45ml無菌水中制成濃度為10“的溶液，再從中取出0.5ml溶液加入到4.5ml水中制成濃度為1（T2的溶液，以此類推，制的濃度為10_2,10'10_4,10_5的溶液，用涂布平板法將這五種濃度的細菌懸浮液分別轉(zhuǎn)移到5個BCG牛乳培
5、養(yǎng)基上，45QC的恒溫箱中倒置培養(yǎng)48h48h之后在BCG培養(yǎng)基上出現(xiàn)很多菌落，其中菌落周圍培養(yǎng)基變成透明狀，即為嗜熱鏈球菌的疑似菌落（菌落特征：黃色或紅色，扁平，邊緣不整齊的菌落）（3）純培養(yǎng)挑選培養(yǎng)基上的菌落，劃線純化2?3次,最后選擇單菌落，經(jīng)過鏡檢確認為純種，得到7個菌株，4°C斜面保存。將菌落平板和細胞形態(tài)在鏡檢下用相機照出(4)液體培養(yǎng)將純培養(yǎng)之后的單菌落無菌操作至液體BCG培養(yǎng)基，與45°C搖床上培養(yǎng)24h(1)鑒定方法1.顯微鏡觀察：①直接觀察：鏈球狀通常有2球體連接、3、4球體連接、5、6球體連接的，8球體以上連接的和單球體的少見，2.耐熱性實驗：將帶
6、有菌種的培養(yǎng)皿放入45°C的恒溫箱中恒溫培養(yǎng)2?3天，并觀察結(jié)果。3.菌種的革蘭氏染色和形態(tài)觀察用無菌接種環(huán)取一環(huán)菌均勻涂布在滴有無菌水的載玻片上，自然風(fēng)干。固定后進行革蘭氏染色。染色后用顯微鏡油鏡進行觀察。菌體革蘭氏染色為藍紫色，革蘭氏陽性革蘭氏陽性。菌體球形或卵圓形，排列成對或形成長短不等的鏈狀。4.抑制性實驗：①大腸桿菌培養(yǎng)：熬制大腸桿菌培養(yǎng)基(金色葡萄球菌)，倒入3培養(yǎng)皿中，冷卻后備用②將滅菌后的鑷子將無菌濾紙浸入嗜熱鏈球菌提取液中，并在容器壁瀝去多余的溶液，再將濾紙條貼在大腸桿菌培養(yǎng)基如圖所示的位置，并如圖所示，將金色葡萄球菌和大腸桿菌畫線，同時制作一個空白對
7、照試驗，37QC倒置培養(yǎng)24h注：濾紙條形狀要規(guī)則，濾紙條上含有的溶液量不要太多，而且在貼濾紙時不要在培養(yǎng)基上拖動濾紙條，避免提取液在培養(yǎng)基中擴散時分布的不均勻，同時注意劃線接種時要盡量靠近濾紙條，但不要接觸，避免將濾紙條上的提取液與菌種混合觀察大腸桿菌和金色葡萄球菌菌落是否受到抑制，收到抑制菌落直徑大約是原來直徑的30%（金色葡萄球菌受抑制的直徑大約是原來的20%)參考文獻1.彭磊，司紅麗.酸奶中嗜熱鏈球菌初步分離與鑒定.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技[J]:2011年第15期2.佟瀟.酸奶中嗜熱鏈球菌的分離和鑒定[M].齊齊哈爾大學(xué)：20043.百度百
