nogob在lps誘導的巨噬細胞免疫應答中的作用及其機制初探

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1、Nogo-B在LPS誘導巨噬細胞免疫應答中的作用及其機制初探摘要背景：急性肺損傷(Acutelunginjury，ALI)是呼吸系統(tǒng)常見的危重癥之一，微生物感染、外傷、毒氣、污染物、自身抗體、胃酸、栓塞和自由脂肪酸等多種生物、物理和化學因素均可導致ALI。盡管在過去幾十年中人們對ALI的認識不斷加深，在治療上也取得了重大進步，但ALI的死亡率(約27％到45％不等)仍居高不下，且ALI的發(fā)生、發(fā)展機制也尚無定論。鑒于當前臨床上ALI患者面臨著高死亡率、低治愈率和差的生活質(zhì)量的現(xiàn)實，探明ALI的病理生理機制從而找到有效的治療措施迫在眉睫。肺泡巨噬細胞(A

2、lveolarMacrophages，AM)作為肺部主要的固有免疫細胞，在ALI的發(fā)生、發(fā)展中起著關鍵作用。眾所周知，巨噬細胞是免疫系統(tǒng)的重要成分之一，參與了各種炎癥的固有免疫應答和適應性免疫應答，此外，在損傷修復、組織重構(gòu)及纖維化等過程中也起著重要作用。Nogo—B是網(wǎng)狀蛋白家族(reticulonsuper．familyproteins，RTNs)中的成員，因參與了多種細胞生物學過程，近來成為了國內(nèi)外的研究熱點，研究發(fā)現(xiàn)Nogo．B可以調(diào)節(jié)巨噬細胞的募集，調(diào)控巨噬細胞遷移、粘附、吞噬、炎癥因子分泌及殺傷作用等生物學功能，同時內(nèi)源性的Nogo．B還可

3、能與巨噬細胞的活化和轉(zhuǎn)運有關。然而，在ALI狀態(tài)下，Nogo．B是如何調(diào)控巨噬細胞的免疫應答目前尚不明確。我們在前期的研究中觀察到ALI小鼠的肺泡灌洗液(Bronchoalveolarlavagefluid，BALF)細胞中，肺氣道、血管及肺泡上皮組織@Nogo．B的表達水平均較正常小鼠降低，以BALF細胞降低最為顯著，而BALF中的細胞成分主要為AM。因此，我們推澳lJNogo．B對AM的功能發(fā)揮起著至關重要的作用。為了證實上述推論并初步闡明其分子機制，本研究選用小鼠巨噬細胞株RAW264．7為研究對象，在LPS束U激下研究Nogo．B對巨噬細胞分泌

4、、遷移、抗原提呈等免疫應答過程的影響并初步探討其機制。7j法：一、選擇小鼠巨噬細胞株RAW264．7作為本實驗的研究對象，加入胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37"C，5％C02濃度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。用Westernblot檢測巨噬細胞RAW264．7內(nèi)不同LPS濃度下以及LPS刺激后不同時間段內(nèi)Nogo．B表達水平。二、分別采用腺病毒轉(zhuǎn)染和siRNA干擾的方法上調(diào)和下調(diào)巨噬細胞中Nogo．B的表達水平，選擇LPS刺激的最佳濃度和時長，采用ELISA方法檢測巨噬細胞炎癥因子的釋放情況，Transwell實驗觀察巨噬細胞的遷移能力的變化，流式

5、細胞術檢測巨萬方數(shù)據(jù)第二軍醫(yī)大學碩士學位論文噬細胞表面MHCHI進而評估其抗原提呈能力，以及WestemBlot方法檢測MSRl進而判斷巨噬細胞的吞噬能力。三、探索LPS刺激下Nogo．B影響巨噬細胞功能可能的機制。采用流式細胞術檢測不同Nogo．B表達水平的巨噬細胞表面TLR4的表達情況，WesternBlot方法檢測不同Nogo．B表達水平的巨噬細胞中MAPK通路相關分子ERK、JNK和P38的磷酸化水平，以初步闡明Nogo．B通過TLR4．MAPK通路調(diào)控巨噬細胞的生物學功能。結(jié)果：一、LPS誘導巨噬細胞表達Nogo-B的變化規(guī)律巨噬細胞Nogo

6、．B蛋白隨著LPS刺激濃度的增高而降低，即Nogo-B蛋白的表達水平呈現(xiàn)LPS濃度依賴性降低，在LPS濃度為199／ml時降至最低。當LPS刺激濃度為199／ml時，巨噬細胞中Nogo-B的表達水平隨著LPS刺激時間的延長而逐漸下降，在刺激后的24h其表達量降至最低并一直持續(xù)到48h。二、LPS刺激后，調(diào)控Nogo．B表達對巨噬細胞免疫應答的影響(一)、LPS刺激后，過表達Nogo．B的RAW264．7炎癥因子TNF．Q，MCP．1和TGF．D的分泌均較對照組顯著增加：而低表達Nogo．B的RAW264．7炎癥因子TNF．Q，IL．1D，MCP．1和T

7、GF．D的分泌水平顯著受到抑制。(二)、LPS刺激24h后，過表達Nogo．B的RAW264．7遷移能力較對照組升高1．8倍；而低表達Nogo．B的RAW264．7則遷移能力較對照組減低1．5倍。(三)、LPS刺激后MHCII在過表達Nogo—B的RAW264．7中表達量隨著LPS刺激時間的推移顯著增加，而在低表達Nogo．B的RAW264．7中，MHCII的表達量顯著低于對照組。調(diào)控Nogo．B的表達水平，MHCI的表達未見明顯變化。(四)、LPS刺激后24h，MSRl在過表達Nogo．B的RAW264．7中其表達量明顯升高，而在低表達Nogo—B的

8、RAW264．7中顯著減少。三、Nogo-B影響巨噬細胞表面TLR4的表達并調(diào)節(jié)MAPK通路的