犢牛腹瀉病原菌分離鑒定及藥敏試驗

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1、犢牛腹瀉病原菌分離鑒定及藥敏試驗國家肉牛牦牛產業(yè)技術體系崗位專家鄧立新摘要：商丘某肉牛養(yǎng)殖場大量犢牛發(fā)生腹瀉，為了研究引起犢牛腹瀉的病原菌，本試驗從商丘某肉牛養(yǎng)殖場無菌采集腹瀉犢牛的新鮮糞便，進行細菌的增菌培養(yǎng)、純化、質譜試驗和藥敏試驗。結果表明，分離的細菌在形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性、耐藥性等方面與大腸埃希氏菌、沙門氏菌、克雷伯氏菌基本相同，通過質譜鑒定為大腸埃希氏菌、沙門氏菌和克雷伯氏菌。藥敏試驗結果表明該分離菌對氨卡西林、青霉素等耐藥，對環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、恩諾沙星等敏感。試驗結果為臨床用藥及預防提供了理論依據。關鍵詞：犢牛腹瀉；細菌分離鑒定；飛行時間質譜；藥敏試驗犢

2、牛腹瀉是新生犢牛常發(fā)的一種急性腹瀉，引起犢牛腹瀉的病因很多，包括細菌、病毒、寄生蟲等病原微生物以及營養(yǎng)因素和環(huán)境因素等[1]。僅大腸埃希菌病造成的死亡，就占肉用犢牛死亡總數的75%，該病的發(fā)生嚴重影響著犢牛的生長發(fā)育和成年后的生產性能，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經濟損失[2]。此外，由于臨床中抗菌藥物的大量應用，甚至濫用，導致了大腸埃希菌等細菌耐藥性的產生和擴散，給犢牛腹瀉病的防治造成了一定困難，而且動物源性帶耐藥質粒的腸道菌可通過畜禽產品的加工、食用等過程傳播到人類，對人類健康具有潛在性危害[3]。但由于近年來隨著質譜技術的快速發(fā)展，軟電離方式的出現，基質輔助激光解吸電離飛行時間質

3、譜能夠對蛋白質、核酸及脂類等生物大分子進行快速、準確的分析，進而使得其被應用于細菌的檢測及鑒定[4-5]。本試驗從河南省民權縣某肉牛養(yǎng)殖場無菌采集腹瀉犢牛糞便病料，進行病原分離，對分離菌株進行分離培養(yǎng)、鏡檢、生化試驗、藥敏試驗及飛行時間質譜試驗，希望為犢牛腹瀉病的防治提供依據。1材料與方法1.1材料1.1.1試驗地點、時間本試驗從2015年1月至4月間在河南農業(yè)大學微生物實驗室進行。1.1.2病料棉拭子無菌采集民權縣某肉牛場腹瀉犢牛糞便。1.1.3主要試劑藥敏片購自于杭州濱和微生物試劑有限公司，規(guī)格為5μg/片、20片/瓶，藥敏稀釋法所用的藥物由河南農業(yè)大學提供（青霉素鈉、頭

4、孢噻呋鈉、頭孢吡肟、氨卡西林鈉、硫酸慶大霉素、泰妙菌素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、阿莫西林、鹽酸四環(huán)素、氟苯尼考、多西環(huán)素），藥物濃度為512mg/ml；麥康凱培養(yǎng)基（MK），SS瓊脂培養(yǎng)基，普通肉湯培養(yǎng)基，普通瓊脂培養(yǎng)基，MHB瓊脂培養(yǎng)基，三糖鐵培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基均按常規(guī)方法配制[6]。95%酒精，革蘭氏染液，甲基紅，1%氫氧化鈉溶液等指示劑。1.1.4主要儀器設備顯微鏡（JnoecXS-212-202）、恒溫培養(yǎng)箱、烘干箱、高壓滅菌鍋、冰箱(海爾)等。1.2方法1.2.1病料處理將采集的病料接種于普通肉湯培養(yǎng)基中在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24h。1.2.2細菌的分離培養(yǎng)7將病料

5、接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～24h，待肉湯渾濁后接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上劃線分離得到單個菌落，挑取菌落形態(tài)不同的單個菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)中，37℃培養(yǎng)12～24h，用接種環(huán)從試管中挑取一環(huán)進行抹片固定和革蘭染色，鏡檢[7-9]。根據菌體形態(tài)及染色特性初步判定細菌種類，各類細菌按相應生化特性做進一步的鑒定。1.2.3細菌的鑒定(1)將革蘭染色呈陰性桿菌，接種在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、和三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)12～24h，觀察是否符合大腸桿菌、沙門氏菌、克雷伯氏菌的培養(yǎng)特性（2）所分離細菌的24h純培養(yǎng)物進行甲基紅試驗／V—P試驗、吲哚等生化鑒定試驗

6、。1.2.4細菌的Maldi-Tof-Ms（飛行時間質譜）和VITEK（生化鑒定儀）鑒定將純化好的新鮮菌種從普通肉湯培養(yǎng)基中提取一環(huán)在麥康凱培養(yǎng)基中進行劃線，37℃培養(yǎng)12～24h，在河南省出入境檢驗檢疫局進行細菌的飛行時間質譜和生化鑒定。1.2.5藥敏試驗-紙片法（1）測試菌液的制備選取商丘市民權縣某肉牛場犢牛糞便中已經鑒定出的大腸桿菌株從保存菌株中提取2～3接種環(huán)，接種于含5mL營養(yǎng)肉湯試管中，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。（2）藥敏紙片試驗用1000μL量程的移液槍從試管中吸取100μL菌液，打入提前制備好的MHB瓊脂培養(yǎng)基中，用涂布棒均勻的涂抹使菌液中的水分被培養(yǎng)基

7、完全吸收后方可貼藥敏片。用無菌鑷子取藥敏紙片貼在平板表面，每個平板貼6張紙片，每張紙片間距不少于24mm，外圍紙片中心距平皿邊緣不少于15mm。將平板放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24h后取出，用直尺測量抑菌圈直徑，結果判斷依據藥敏紙片判定標準。（圖1）（3）結果判定標準抑菌效果按照《藥理學》中的標準判定，抑菌直徑>20mm為極敏感；15～19mm為高度敏感；10～14mm為中度敏感；10mm以下為低敏[6-9]。1.2.6藥敏試驗-稀釋法（1）將保存在肉湯中的菌液劃線于麥康凱培養(yǎng)基上培養(yǎng)12～24h，次