menke體外產(chǎn)氣法

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1、Menke體外產(chǎn)氣法（Syringe系統(tǒng)）——管子（一）基礎(chǔ)知識體外產(chǎn)氣法主要理念通過體外產(chǎn)氣裝置模擬瘤胃發(fā)酵體外產(chǎn)氣系統(tǒng)組成體外產(chǎn)氣裝置：產(chǎn)氣管（相當于獨立的瘤胃）、恒溫水浴搖床（模擬瘤胃溫度和蠕動速度）；微生物培養(yǎng)液：由瘤胃液與人工唾液按1:2的體積比混合，攪拌均勻而成影響實驗成敗的主要因素實驗過程中產(chǎn)氣裝置的溫度，整個操作過程的厭氧狀態(tài)、微生物活力是影響實驗成敗的關(guān)鍵（二）試驗前準備試配產(chǎn)氣管①更換注入口處老化的塑膠管；②試配外管和內(nèi)塞，要求推拉自如又不過松（現(xiàn)已將可匹配的外管和內(nèi)塞統(tǒng)一編號，依號裝配即可）。稱量樣品①產(chǎn)氣管編號；②用自制的帶長柄的稱量紙，準確稱取待測樣品約200mg（

2、DM），置于體外產(chǎn)氣管底部，注意不要讓樣品進入產(chǎn)氣管注入口和沾染30ml以上管壁；③樣品稱取完畢后，管塞上均勻涂抹凡士林，將管塞塞回對映的外管，扣好夾子。配制原液正式實驗前一天，配制好人工唾液中的微量元素溶液（A液）、緩沖液（B液）、常量元素溶液（C液）和刃天青溶液（D液）（可過量配制，常溫下存放，配制方法見附表1）。其它①調(diào)試恒溫水浴搖床的溫度至39±0.5℃，搖動速度5×10轉(zhuǎn)/min，如果使用兩個恒溫水浴搖床要求兩者溫度和搖動速度盡量一致，另外還需要將一多聯(lián)水浴鍋溫度調(diào)至39±0.5℃（以實際量取溫度為準）；②準備二層、四層、六層紗布各2-4塊（紗布可重復(fù)使用）；③貯備兩瓶熱水，準備收

3、集瓶（收集和過濾瘤胃液用）、水桶、溫度計，以備次日取瘤胃液用。（三）正式試驗配制人工唾液①將恒溫水浴搖床、多聯(lián)水浴鍋打開后；②計算人工唾液需要量：體外培養(yǎng)時每根產(chǎn)氣管內(nèi)微生物培養(yǎng)液的體積是30ml（10ml瘤胃液和20ml人工唾液），依據(jù)試驗設(shè)計的產(chǎn)氣管數(shù)計算人工唾液和瘤胃液的需要量（預(yù)留20%，以備操作手法不當造成浪費）；③配制還原劑（E液，見附表1）；④按附表2的順序和比例將配制好的各原液混合后，置入水浴搖床或水浴鍋內(nèi)，通入CO2氣體（氣流不易過大），使人工唾液由藍色轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色，最終為無色。采集與處理瘤胃液為方便讀取12h產(chǎn)氣量，瘤胃液最好在7:30前取回。所取瘤胃液為早飼前2h瘤胃液

4、。①到牧場后，將熱水倒入水桶，調(diào)節(jié)水溫度至39±0.5℃，用于瘤胃液保溫（應(yīng)經(jīng)常用熱水調(diào)節(jié)）；②用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶（注意蓋上瓶蓋，以防氧氣對微生物的影響）；③回到實驗室后，將收集瓶置于水浴鍋內(nèi)，四層紗布過濾（應(yīng)盡量快，以保持微生物的活力），獲得的濾液用CO2氣體飽和；④用量筒量取所需量的無色人工唾液和瘤胃液混合，不間斷地通入CO2氣體。吸取微生物培養(yǎng)液用空的產(chǎn)氣管吸取微生物培養(yǎng)液30ml，通過三通管推入已經(jīng)裝有樣品的產(chǎn)氣管。記錄初始微生物培養(yǎng)液量排氣過程：將注入口處夾子打開的同時，用手下拉管塞，以防樣品沖入塑膠管；搖晃產(chǎn)氣管使樣品與瘤胃液混合后，旋轉(zhuǎn)管塞，排出管內(nèi)

5、空氣；讀數(shù)：將產(chǎn)氣管豎直，注入口向下，讀取刻度。排氣后的產(chǎn)氣管應(yīng)隨機置于恒溫水浴搖床內(nèi)培養(yǎng)（搖床在操作過程中處于搖動狀態(tài)，以免溫度上升）?？瞻讓φ蘸蜆藴蕦φ?6實驗過程中要有至少3個空白對照和3個標準干草對照（樣多時，對照一定要多，尤其是空白對照）?？瞻讓φ詹患訕悠分苯蛹尤?0ml微生物培養(yǎng)液，標準干草對照以200mg（DM）干草（優(yōu)質(zhì)的過80目篩的羊草）為底物，加入30ml微生物培養(yǎng)液。為了消除操作順序和恒溫水浴搖床條件的差異，要求空白對照和標準對照平均分布于試驗前期、中期和后期，放置于水浴搖床的不同位置。整個過程要盡量快，特別是吸培養(yǎng)液和排氣，最好不要超過15min記錄產(chǎn)氣量培養(yǎng)2、4、

6、6、9、12、24、36、48、72、96h時（試驗樣品為粗料，一般培養(yǎng)到72h或96h；精料一般培養(yǎng)到24h或48h即可終止培養(yǎng)，若要計算產(chǎn)氣常數(shù)，一般要72h），記錄產(chǎn)氣管的刻度讀數(shù)（讀數(shù)時輕搖產(chǎn)氣管，旋動管塞后讀數(shù)，讀數(shù)時，以管塞刻度的中部為準）。如果產(chǎn)氣量過多，下一時間點產(chǎn)氣量可能超出刻度范圍，則需放氣，其操作與排氣相同。產(chǎn)氣量計算（管子）式中，GPt為樣品在t時刻的產(chǎn)氣量（ml）；Vt為樣品發(fā)酵t小時后，產(chǎn)氣管刻度讀數(shù)（ml）；V0為樣品在開始培養(yǎng)時產(chǎn)氣管刻度讀數(shù)（ml）；W為樣品干物質(zhì)重（mg）；GP空白為空白對照在t時刻的產(chǎn)氣量，其計算方式與GPt一致。重復(fù)試驗要求體外產(chǎn)氣試驗

7、至少培養(yǎng)兩次，兩次標準干草產(chǎn)氣量相對偏差小于10%（若標準干草產(chǎn)氣量與實驗室積累的平均值29.5相差太大，應(yīng)考慮重作，檢查動物狀況）。(四)樣品采集測定項目取樣時間取樣部位取樣量重復(fù)數(shù)處理保存溫度VFA實際需要上清液1ml-加入0.2ml8.2%偏磷酸，20000g離心10min4℃NH3-N24或48h混合液5ml--20℃MCP24或48h混合液24ml--20℃附表1：人工唾液原液配制表A、微量元素溶液