western blot 技術(shù)

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1、Westernblot實驗技術(shù)一、原理WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶、熒光或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達。WesternBl

2、ot按實驗步驟分主要包括兩部分：①SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（主要目的為按分子量大小對蛋白質(zhì)進行分離）；②Western?印跡?（在韌性支持物上通過抗原抗體雜交后的顯色強弱反應(yīng)蛋白豐度）。1．SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：該技術(shù)首先在1967年由Shapir0建立，1969年由weber和Osborn進一步完善。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺(簡稱Acr)和交聯(lián)劑N，N’一亞甲基雙丙烯酰胺(簡稱Bis)在催化劑過硫酸銨(AP)，N，N，N’，N’四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交聯(lián)向成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，并以此為支

3、持物進行電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同遷移率將蛋白質(zhì)分離成若干條區(qū)帶，如果分離純化的樣品中只含有同一種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)樣品電泳后，就應(yīng)只分離出一條區(qū)帶。SDS是一種陰離子表面活性劑能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物在電泳時的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響。這種電泳方法稱為SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱SDS—PAG

4、E)。由于SDSPAGE可設(shè)法將電泳時蛋白質(zhì)電荷差異這一因素除去或減小到可以忽略不計的程度，因此常用來鑒定蛋白質(zhì)分離樣品的純化程度，如果被鑒定的蛋白質(zhì)樣品很純，只含有一種具三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或含有相同分子量亞基的具四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，那么SDS—PAGE后，就只出現(xiàn)一條蛋白質(zhì)區(qū)帶。SDS—PAGE具有以下特性：(1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；(2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；(3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定；(4)幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重

5、復(fù)性好；(5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。實驗?zāi)Ｊ綀D結(jié)果圖?2．?Western?印跡?：經(jīng)過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳按分子量大小分離后的蛋白質(zhì)，在電場中轉(zhuǎn)移到固相支持物上（常用硝酸纖維素濾膜）。而后以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的

6、第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。轉(zhuǎn)膜模式圖雜交模式圖二、實驗準(zhǔn)備一抗體選購流程（1）首先確定研究的抗原分子的正式及別用名，明確針對的種屬，明確除WB以外擬開展的實驗種類（如：FlowCyt,ICC/IF,IHC-Wmt,IHC-Fr,IHC-P,IP,）。（2）從常用信譽較好公司網(wǎng)站查詢符合（1）中要求的抗體，國外公司包括：Abcam，ABGENT，cellsignaling，Abnova，chemicon，novus，BD，epitomics。國內(nèi)推薦：三鷹，中

7、杉金橋，天德悅。仔細閱讀抗體說明書，需要考慮因素包括：是否有文獻已發(fā)表，抗體效價，到貨周期，抗體價格，單抗多抗，包裝規(guī)格，抗體克隆號，并依據(jù)一抗種屬選擇相應(yīng)的二抗。（注意：一般國外抗體到貨時間為3-5周，國內(nèi)抗體3-5天）（3）訂購成功后，定期與抗體代理公司聯(lián)系，核實抗體狀態(tài)并督促其及時到貨。（4）收到抗體后，第一時間分裝抗體避免反復(fù)凍融（置于冰上，推薦10ul每支分裝并保存于-20℃）。妥善保管說明書，建議打印一份放實驗室，原版放辦公室。（5）每批訂購的抗體至少保存5ul存底，用于重要實驗驗證。二抗選購流程二抗主要

8、選擇國內(nèi)抗體，本實驗室選擇天德悅公司產(chǎn)品，使用者主要需考慮種屬問題。樣本制備（1）樣本制備前需明確實驗?zāi)康?，并根?jù)下述實驗方法選擇合適的實驗體系，如：待檢測蛋白所處位置（細胞漿，細胞膜，分泌蛋白等）（2）盡量保持細胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性（即實驗的可重復(fù)性），如:細胞的培養(yǎng)密度，更換培養(yǎng)液時間等。（3）如使用蛋白酶處理，可能會將目的蛋白降解，同時還引入了