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1、WesternBlot技術(shù)姓名：========印跡法◆Southern印跡法◆Northern印跡法◆Western印跡法◆Eastern印跡法印跡法（blotting）:將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法。CompanyLogoWesternBlot原理在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來(lái)檢測(cè)。CompanyLogoWesternBlot原理經(jīng)電泳分離后的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體
2、起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。CompanyLogoWesternBlot操作步驟一.制備、處理蛋白樣品◆通過(guò)有機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白通過(guò)層析或電洗脫法制備目的蛋白◆將待分離的蛋白樣品與樣品緩沖液按4:1比例混合(50～100μg蛋白),沸水煮沸10min,立即插入碎冰中備用。CompanyLogoWesternBlot操作步驟二.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳◆制備聚丙烯酰胺凝膠：將玻璃板洗凈,水不掛壁為準(zhǔn),晾干,底邊和兩側(cè)對(duì)齊,兩側(cè)夾緊,立于制膠架上。根據(jù)所要分析的蛋白質(zhì)分子量大小配制分離膠,沿玻璃板上的左
3、上角位置連續(xù)平穩(wěn)注入兩層玻璃板中,待分離膠聚合、凝固后,將積層膠溶液也沿玻璃板左上角注入后立即插入梳子。CompanyLogoWesternBlot操作步驟二.SDS聚丙烯酰胺凝膠◆上樣：將制備好的凝膠(帶著梳子)小心從制膠架上取下,放置于電泳槽槽中,將電泳緩沖液注入電泳槽中,緩慢拔出梳子，吸取處理好的蛋白樣品20～30LL點(diǎn)樣?！綦娪荆捍蜷_(kāi)電源,選擇穩(wěn)壓模式電泳(也可選擇恒流電泳),80～200V工作電壓，積層膠用80-100V,分離膠用150-200V。待溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部時(shí)(約1h后)停止電泳。CompanyLogoWesternBlot操作步驟三.轉(zhuǎn)膜◆取膠：電泳結(jié)束后用塑料板小心將
4、膠從兩塊玻璃板之間剝離出來(lái)，用轉(zhuǎn)移緩沖液洗凈。◆制作轉(zhuǎn)移三明治：打開(kāi)轉(zhuǎn)移盒，三明治順序：正極面——海綿墊——3張Whatman濾紙——PVDF膜——凝膠——3張Whatman濾紙——海綿墊——負(fù)極面。關(guān)上轉(zhuǎn)移盒。CompanyLogoWesternBlot操作步驟三.轉(zhuǎn)膜◆轉(zhuǎn)移：將轉(zhuǎn)移盒放入轉(zhuǎn)移槽，正極面對(duì)紅板，負(fù)極面對(duì)黑板，加滿轉(zhuǎn)移緩沖液，通電轉(zhuǎn)移，將轉(zhuǎn)移槽放入4℃冰箱內(nèi)，200mA轉(zhuǎn)移2h?！粝茨ぃ捍蜷_(kāi)三明治，取膜。將膜浸泡于TBST中，置于搖床上洗膜10min.CompanyLogoWesternBlot操作步驟四.封閉◆將轉(zhuǎn)移膜取下，用PBS漂洗,放入小塑料袋中,加入適量新鮮封閉液,擠
5、趕氣泡,用電熱封口機(jī)封口后室溫下放在搖床上搖。CompanyLogoWesternBlot操作步驟五.免疫反應(yīng)◆加一抗：將封閉過(guò)的膜取出,再放入一新塑料袋中,加入一抗液,擠趕氣泡,封口。室溫下在搖床上搖1h,或4℃冰箱放置過(guò)夜?！粝茨ぃ河肨BST洗膜液洗去未結(jié)合靶蛋白的抗體?！艏佣梗簩⑵催^(guò)的膜放入新塑料袋中,加入二抗液。室溫下在水平搖床上搖2h。CompanyLogoWesternBlot操作步驟六.底物顯色◆化學(xué)發(fā)光反應(yīng)(ECL)檢測(cè)◆放射自顯影◆底物熒光ECF◆底物DAB呈色CompanyLogoWesternBlot操作步驟六.底物顯色◆化學(xué)發(fā)光反應(yīng)(ECL)檢測(cè)：取出洗過(guò)的濾膜,先
6、在濾紙上瀝干。將膜放入小暗盒中,加發(fā)光液于膜上,室溫孵育3min,立即準(zhǔn)備壓片曝光。CompanyLogoWesternBlot操作步驟六.底物顯色◆曝光及沖洗X光膠片：在暗室中觀察發(fā)光條帶的強(qiáng)度,確定曝光時(shí)間。將X光膠片放在暗盒中的濾膜上,蓋嚴(yán),計(jì)時(shí)曝光,沖洗X光片?！舴治觯河媚z成像系統(tǒng)掃描圖像，檢測(cè)積分吸光度值,分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。CompanyLogoWesternBlot所用儀器CompanyLogoWesternBlot常見(jiàn)問(wèn)題分析一.條帶比正常的窄？出現(xiàn)“微笑”或“倒微笑”條帶？◆凝膠聚合不均勻，灌膠時(shí)候盡量混合均勻，動(dòng)作輕緩；◆拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把
7、上樣帶扭曲；◆樣品鹽濃度過(guò)高會(huì)擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度；◆膠板底部有氣泡會(huì)影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時(shí)注意電泳槽裝置是否合適。CompanyLogoWesternBlot常見(jiàn)問(wèn)題分析二.凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？轉(zhuǎn)膜緩沖液過(guò)熱？◆可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min；◆電轉(zhuǎn)儀長(zhǎng)期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致?？稍趦蓧K海綿之
