《遺傳實(shí)驗(yàn)》word版

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1、實(shí)驗(yàn)五細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取一實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諌A裂解法提取質(zhì)粒的方法。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容本實(shí)驗(yàn)涉及細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒的提取方法。三、實(shí)驗(yàn)要求采用集中授課、學(xué)生自主訓(xùn)練并重的模式組織教學(xué)。四、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備學(xué)生需要與質(zhì)粒相關(guān)的知識(shí)。五、實(shí)驗(yàn)原理、方法和手段質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線(xiàn)菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄

2、要依賴(lài)于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開(kāi)宿主細(xì)胞則不能存活。質(zhì)粒通常含有編碼某些酶的基因，如抗生素抗性基因、大腸桿菌素基因、腸毒素基因某些限制性?xún)?nèi)切酶與修飾酶基因等，因而它的存在使宿主具有一些額外的特性。F質(zhì)粒（又稱(chēng)F因子或性質(zhì)粒）、R質(zhì)粒(抗藥性因子)和Col質(zhì)粒（產(chǎn)大腸桿菌素因子）等都是常見(jiàn)的天然質(zhì)粒。質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類(lèi)型：緊密控制型（Stringentcontrol）和松馳控制型（Relaxedcontrol）。前者只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，當(dāng)染色體不復(fù)制時(shí)，它也不能

3、復(fù)制，通常每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有1個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒分子，如F因子。后者的質(zhì)粒在整個(gè)細(xì)胞周期中隨時(shí)可以復(fù)制，在每個(gè)細(xì)胞中有許多拷貝，一般在20個(gè)以上，如ColE1質(zhì)粒。在使用蛋白質(zhì)合成抑制劑氯霉素時(shí)，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、染色體DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂均受到抑制，緊密型質(zhì)粒復(fù)制停止，而松馳型質(zhì)粒繼續(xù)復(fù)制質(zhì)?？截悢?shù)可由原來(lái)的20多個(gè)擴(kuò)增至1000-3000個(gè)，此時(shí)質(zhì)粒DNA占總DNA的含量可由原來(lái)的2%增加至40-50%。利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中共同存在，當(dāng)兩種質(zhì)粒同時(shí)導(dǎo)入同一細(xì)胞時(shí),它們?cè)趶?fù)制

4、及隨后分配到子細(xì)胞的過(guò)程中彼此競(jìng)爭(zhēng)，在一些細(xì)胞中，一種質(zhì)粒占優(yōu)勢(shì)，而在另一些細(xì)胞中另一種質(zhì)粒卻占優(yōu)勢(shì)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)幾代后，占少數(shù)的質(zhì)粒將會(huì)丟失，因而在細(xì)胞后代中只有兩種質(zhì)粒的一種，這種現(xiàn)象稱(chēng)質(zhì)粒的不相容性（Incompatibility）。但利用不同復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒則可以穩(wěn)定地共存于同一宿主細(xì)胞中。把一個(gè)有用的目的DNA片段通過(guò)重組DNA技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工具叫載體（Vector）。細(xì)菌質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作而進(jìn)行人工構(gòu)建的

5、。一個(gè)理想的克隆載體大致應(yīng)有下列一些特性：（1）分子量小、多拷貝、松馳控制型；（2）具有多種常用的限制性?xún)?nèi)切酶的單切點(diǎn)；（3）能插入較大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的檢測(cè)表型。常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb至10kb之間，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBS等。與天然質(zhì)粒相比，質(zhì)粒載體通常帶有一個(gè)或一個(gè)以上的選擇性標(biāo)記基因（如抗生素抗性基因）和一個(gè)人工合成的含有多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作。大多數(shù)質(zhì)

6、粒載體帶有一些多用途的輔助序列，這些序列可用于產(chǎn)生序列測(cè)定的單鏈DNA、體外轉(zhuǎn)錄外源DNA、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達(dá)等。從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可以破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基磺酸鈉（SDS）和TritonX-100可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS或TritonX-100處理后，細(xì)菌染色體DNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上，同時(shí)由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多，易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同

7、大小的線(xiàn)性片段。當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線(xiàn)性染色體DNA變性，而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalentlyclosedcircularDNA，簡(jiǎn)稱(chēng)cccDNA）的兩條鏈不會(huì)相互分開(kāi)，當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線(xiàn)狀染色體DNA片段難以復(fù)性,，而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起。而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過(guò)程中，除了超螺旋DNA外，還會(huì)產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條

8、鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松馳型的環(huán)狀分子，稱(chēng)開(kāi)環(huán)DNA（OpencircularDNA,簡(jiǎn)稱(chēng)ocDNA）；如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線(xiàn)狀DNA（LinearDNA）。當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA電泳時(shí)，同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動(dòng)速度要比開(kāi)環(huán)和線(xiàn)狀分子的泳動(dòng)速度快。六、實(shí)驗(yàn)條件（一）菌株含PUCm-T質(zhì)粒的大腸桿菌（E.coli）DH5α菌株。（二）實(shí)驗(yàn)儀器及用具1.5mLEppendorf離心管，微量取液器，臺(tái)式高速離心機(jī)，恒溫振蕩搖床，高壓蒸汽消毒器(