蛋白免疫印跡雜交

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1、蛋白免疫印跡雜交（WesternBlot）技術(shù)手冊·蛋白免疫印跡雜交（WesternBlot）技術(shù)手冊?蛋白免疫印跡雜交（WesternBlotWB）是將蛋白樣本通過聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，再轉(zhuǎn)移到雜交膜（blot）上，然后通過一抗/二抗復(fù)合物對靶蛋白進行特異性檢測的方法。WB是進行蛋白質(zhì)分析最流行和成熟的技術(shù)之一。本指南討論WesternBlot操作方法及常見問題分析，有助于成功完成WB。???A蛋白樣本提取制備?????1細(xì)胞或組織裂解?????2蛋白酶和磷酸酶抑制劑?????3蛋白定量?????4電泳

2、上樣樣品的準(zhǔn)備B?電泳??1PAGE膠的制備?2蛋白分子量Marker?3陽性對照?4內(nèi)參對照?5上樣與電泳C?轉(zhuǎn)膜與顯色（WesternBlot）?1膠中蛋白的檢測?2蛋白轉(zhuǎn)膜?3膜上蛋白的檢測：麗春紅?4膜的封閉?5一抗的孵育?6二抗的孵育7顯色?D常見問題分析與解決方案?附錄1?WB實驗試劑配制方法附錄2?SDS-PAGE膠的配制???????????????????????WB概述:?檢測原理:??A蛋白樣本提取制備??蛋白樣品制備是WesternBlotting的第一步，更是決定WB成敗的關(guān)鍵步驟，??總

3、體原則和注意事項：??1：盡可能提取完全或降低樣本復(fù)雜度只集中于提取目的蛋白（通過采用不同提取方法或選擇不同的試劑盒產(chǎn)品）2：保持蛋白的處于溶解狀態(tài)（通過裂解液的PH鹽濃度表面活性劑、還原劑等的選擇）3：提取過程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修飾等，（低溫操作，加入合適的蛋白酶和磷酸酶抑制劑）4：盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子（通過加入核酸酶或采取不同提取策略）5：樣品分裝，長期于-80℃中保存，避免反復(fù)凍融。?A-1細(xì)胞或組織裂解??????A-1-1細(xì)胞裂解???????裂解液Lysisbuffer或商品化蛋白

4、抽提試劑盒的選擇*目的蛋白分布定位推薦裂解液Lysisbuffe推薦試劑盒全細(xì)胞NP-40orRIPA（附錄1）全蛋白抽提試劑盒細(xì)胞質(zhì)（可溶蛋白）Tris-HCl（附錄1）胞漿蛋白和核蛋白抽提試劑盒線粒體蛋白提取試劑盒細(xì)胞質(zhì)（細(xì)胞骨架等不溶蛋白）Tris-Triton（附錄1）蛋白分級抽提試劑盒細(xì)胞質(zhì)（磷酸化蛋白）?磷酸化蛋白抽提試劑盒細(xì)胞膜NP-40orRIPA（附錄1）膜蛋白抽提試劑盒蛋白分級抽提試劑盒細(xì)胞核RIPA（附錄1）核蛋白抽提試劑盒線粒體RIPA（附錄1）線粒體蛋白抽提試劑盒亞細(xì)胞定位蛋白抽提試劑盒細(xì)

5、胞裂解操作方法：1?培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑（種類與量見本節(jié)2）2?吸凈PBS，加入預(yù)冷的裂解液，（(1mlper107cells/100mmdish/150cm2flask;0.5mlper5x106cells/60mmdish/75cm2flask).3?用細(xì)胞刮子刮取貼壁細(xì)胞，將細(xì)胞及裂解液溫和地轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的微量離心管中，4????????4℃搖動30min5????????4℃離心12,000rpm，20min（根椐細(xì)胞種類不同調(diào)整離心力）6?輕輕吸取上清，轉(zhuǎn)移至新

6、預(yù)冷的微量離心管中置于冰上，即為蛋白樣本，棄沉淀.?A-1-2組織裂解?1?用滅菌的預(yù)冷的工具分離目的組織，盡量置于冰上以防蛋白酶水解，??2?將組織塊放在圓底的微量離心管或Eppendorf管中，加入液氮凍結(jié)組織于冰上均質(zhì)研磨，長期可保存于-80°C，3?每約5mg加入約300μl預(yù)冷的裂解液lysisbuffer，冰浴勻漿后置于4℃搖動2小時，裂解液體積與組織樣本量有適當(dāng)比例，（最終的蛋白濃度至少達到0.1mg/ml,理想的蛋白濃度應(yīng)為1-5mg/ml).4?4℃離心12,000rpm，20min，輕輕吸取上清

7、，轉(zhuǎn)移至新預(yù)冷的微量離心管中置于冰上，即為蛋白樣本，棄沉淀,?A-2蛋白酶和磷酸酶抑制劑?推薦購商品化蛋白酶和磷酸酶抑制劑復(fù)合試劑盒或COOKTAIL，或按下表配制：?備注：其中Sodiumorthovanadate配制活化方法如下：??所有步聚均需在通風(fēng)櫥中進行：1.用雙蒸水配制100mM正礬酸鈉溶液.2.用鹽酸HCl調(diào)至pH9.03.煮沸至溶液無色,盡量減少水分揮發(fā).4.冷卻至室溫5.再調(diào)pH至9.06.再煮沸至無色7.重復(fù)上述過程,直至溶液煮沸冷卻后達pH9.08.用水定容至原體積9.分裝保存于-20°C.溶

8、液變黃則棄之不用.?A-3?蛋白定量Bradford法Lowry法或BCA法（均有商品化試劑盒可選擇，操作簡單、需分光光度計或酶標(biāo)儀），小牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果裂解液中有NP40或其它表面活性劑，則推薦使用BCA法。三種方法或產(chǎn)品比較列表如下：方法原理靈敏性干擾因素應(yīng)用Lowry法Folin－酚試劑法蛋白質(zhì)在堿性溶液中肽鍵與Cu2+螯合，形