淺談肝硬化患者外周血ip10及其mrna表達(dá)與血清轉(zhuǎn)氨酶水平關(guān)系

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1、從本學(xué)科出發(fā)，應(yīng)著重選對(duì)國民經(jīng)濟(jì)具有一定實(shí)用價(jià)值和理論意義的課題。課題具有先進(jìn)性，便于研究生提出新見解，特別是博士生必須有創(chuàng)新性的成果淺談肝硬化患者外周血IP10及其mRNA表達(dá)與血清轉(zhuǎn)氨酶水平關(guān)系【摘要】　　目的:探討肝硬化患者外周血IP10、IP10mRNA的表達(dá)及其與轉(zhuǎn)氨酶水平的關(guān)系。方法:篩選典型HBV感染后肝硬化患者,以ELISA法檢測(cè)患者血清IP10水平;RealtimePCR檢測(cè)IP10mRNA含量,以lgcDNA/lgGAPDH代表其mRNA水平。結(jié)果:肝硬化患者血清IP10及PBMC中IP10mRNA水平分別為(±)ng/L、±,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

2、意義(P【關(guān)鍵詞】肝硬化IP10mRNAPCR外周血轉(zhuǎn)氨酶肝硬化是肝臟纖維結(jié)締組織彌漫性增生伴有肝細(xì)胞結(jié)節(jié)狀再生,是肝細(xì)胞在多因素作用下反復(fù)損傷的慢性病理過程。IFNγ誘生蛋白10(interferonγinducibleprotEin10,IP10)是1985年Luster等用IFNγ刺激U937細(xì)胞株,從cDNA基因庫中篩選出,屬CXC家族ELR亞族,可由IFNγ、LPS等誘導(dǎo)產(chǎn)生,介導(dǎo)Th1型炎癥反應(yīng),抑制血管新生及腫瘤生長(zhǎng)。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotransferase,ALT)與天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase

3、,AST)及其AST/ALT比值能判斷肝病進(jìn)展及肝病預(yù)后的較好指標(biāo)[1]。為了解IP10與血清轉(zhuǎn)氨酶水平關(guān)系及其在肝硬化發(fā)病機(jī)制中的作用,篩選39例慢性乙肝后肝硬化患者,探討其外周血IP10及其mRNA水平,課題份量和難易程度要恰當(dāng)，博士生能在二年內(nèi)作出結(jié)果，碩士生能在一年內(nèi)作出結(jié)果，特別是對(duì)實(shí)驗(yàn)條件等要有恰當(dāng)?shù)墓烙?jì)。從本學(xué)科出發(fā)，應(yīng)著重選對(duì)國民經(jīng)濟(jì)具有一定實(shí)用價(jià)值和理論意義的課題。課題具有先進(jìn)性，便于研究生提出新見解，特別是博士生必須有創(chuàng)新性的成果現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1材料和方法材料FicollHypaque分離液購自上海試劑二廠;HBVDNA診斷試劑購自上海中亞基因研究所;EL

4、ISA法IP10試劑盒購自法國DLACLONE公司;TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司;cDNA合成試劑購自上海申能博采生物科技有限公司;半自動(dòng)生化儀ECOMF6124購自德國Eppendorf公司;EXL808全自動(dòng)酶標(biāo)儀和EXL50X全自動(dòng)洗板機(jī)購自美國BioTek公司;LightCyclerFastStartDNAMasterSYBRGreenⅠ購自德國Roche公司;iCycle熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀購自美國BioRad公司。檢測(cè)對(duì)象9例肝硬化患者為XX-01/XX-05我校教學(xué)醫(yī)院收治的患者。其中男27例,女12例,年齡～歲,平均歲,ALT升高者18例,

5、AST升高者24例,AST/ALT>者27例;入選患者均為HBV感染者,臨床診斷符合XX年全國病毒性肝炎會(huì)議修訂診斷標(biāo)準(zhǔn),病程均超過6個(gè)月,無合并HAV、HCV、HDV、HEV、HIV感染的實(shí)驗(yàn)室依據(jù),無其他自身免疫性疾病,個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)使用抗病毒和免疫抑制劑治療。另選25例本市中心血站體檢正常獻(xiàn)血員為對(duì)照組,其中男16例,女9例,年齡～歲,平均歲。方法標(biāo)本采集分批采取患者晨起空腹靜脈血mL,課題份量和難易程度要恰當(dāng)，博士生能在二年內(nèi)作出結(jié)果，碩士生能在一年內(nèi)作出結(jié)果，特別是對(duì)實(shí)驗(yàn)條件等要有恰當(dāng)?shù)墓烙?jì)。從本學(xué)科出發(fā)，應(yīng)著重選對(duì)國民經(jīng)濟(jì)具有一定實(shí)用價(jià)值和理論意義的課題。課題具有先進(jìn)性，便于研

6、究生提出新見解，特別是博士生必須有創(chuàng)新性的成果分別置2支含肝素的無菌Eppendorf管和2支滅菌普通管。肝素抗凝血以FicollHypaque常規(guī)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),普通管常規(guī)分離血清備檢。血清IP10檢測(cè)采用ELISA以試劑盒提供標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,每批檢測(cè)設(shè)空白、陰性、陽性對(duì)照各2孔,取100μL待測(cè)血清和100μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗趨化因子單克隆抗體(mAb),加至包被有趨化因子mAb的酶標(biāo)反應(yīng)板孔內(nèi),7℃孵育1h,PBS緩沖液洗滌5次,加100μL底物33甲基苯并噻唑啉6磺酸鹽,室溫30min,加mol/LH2SO4終止反應(yīng),在EXL808全自動(dòng)酶標(biāo)

7、分析儀上(450±2)nm處讀取A值,每孔測(cè)定2次,取均值,依標(biāo)準(zhǔn)曲線確定血清IP10含量。IP10最低檢測(cè)水平IP10mRNA檢測(cè)采用RealtimePCR法。將分離的PBMC以RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)至(1～2)×109個(gè)/L懸液;以TRIzol試劑抽提PBMC總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,置-86℃冰箱備檢。以SYBRGreenⅠ熒光標(biāo)記法檢測(cè)PCR產(chǎn)物,總反應(yīng)體系2μL,包括上下游引物各10pmol,/L,E