膠體金標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用解析

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1、膠體金標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用解析膠體金是氯金酸在還原劑的作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并市于靜電作用形成一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱之為膠體金。膠體金溶液的常見制備方法大致分為白磷還原法、硼氫化鈉還原法、抗壞血酸鹽還原法、檸檬酸三鈉還原法和革柔酸檸檬酸三鈉還原法。其基本原理是向一定濃度的金溶液內(nèi)加入適量還原劑，使金離子還原為金原子。通過改變反應(yīng)體系中氯金酸與還原劑的比例可得到所需不同直徑的金顆粒。一.膠體金標(biāo)記在堿性條件下，膠體金顆粒表面帶負(fù)電荷，可與目標(biāo)蛋白質(zhì)所帶正電荷基團(tuán)之間形成非共價(jià)鍵的靜電吸引而牢固結(jié)合，這種結(jié)合對(duì)所標(biāo)蛋白的生物學(xué)活性無明顯影響。吸附在膠體金表而

2、的抗原或抗體能定向?qū)⒛z體金顆粒載運(yùn)到組織或細(xì)胞內(nèi)、固相載體上相應(yīng)抗體或抗原的位置。由于金顆粒具高電子密度的特性，這些標(biāo)記物在抗原抗體反應(yīng)處聚集達(dá)到一定密度時(shí)(即金顆粒IO,個(gè)出現(xiàn)肉眼可見的粉紅色斑點(diǎn)。膠體金試紙條膠體金試紙卡進(jìn)行膠體金標(biāo)記需耍對(duì)pl［環(huán)境、蛋白/抗體濃度、參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,采用的方法為濃度梯度法。A最適pH選擇pH是標(biāo)記過程的關(guān)鍵決定因素，一般在蛋白/抗體等電點(diǎn)pl略偏堿性的環(huán)境下標(biāo)記效果最好，可以釆用加入0.1M碳酸鉀或者0.1N鹽酸的方法調(diào)節(jié)膠體金溶液的pll。同時(shí)，因?yàn)槟z體金溶液可能損傷探頭，所以常采用精密pH試紙進(jìn)行pH測(cè)定。操作時(shí)將膠體金溶

3、液調(diào)節(jié)到3~10八個(gè)pH梯度，加入被標(biāo)記的蛋白/抗體，混合后室溫放置15min,再加入10%氯化鈉室溫放置15min,記錄保持紅色的最低pH,記為pHo；然后設(shè)置pH梯度為pH(rO.6、pHo-O.3、pH。、pHo+0.3、pHo+0.6、pHo+1,重復(fù)前面的操作,直到找到室溫放置2h仍保持紅色的最低pHo一般我們標(biāo)記抗體IgG最適pH在9.0,單克隆抗體在8?2,SPA（proteinA）在5.9-6.2,其他常用的蛋白標(biāo)記pH見下表：蛋白pH蛋白pH蛋白pH離子交換IgG7.6荊豆凝集素6.3牛血清白蛋白結(jié)合胰島素5.3親和層析抗體&2甘露聚糖7.0霍

4、亂毒素6.9F(ab)27.2過氧化物酶7.8~&2破傷風(fēng)毒素6.9陛麻植物凝集素8.0類卵黏蛋白4.8RNA酶9.(T9.2花生凝集素6.3血漿銅藍(lán)蛋白7.0DNA酶6.0HelixPromatiaLectin7.4脫唾液酸球蛋白6.0~6.5低密度脂蛋白5.5大豆凝集素6.1小牛血清白蛋H6.0~6.5a-巨球蛋白6.0LensPromatiaLectin6.9牛血清白蛋白5.2~5?5抗生物素蛋白10.0~10.6四邊形蓮花凝集素6.3牛血清白蛋白結(jié)合肽4.0~4.5鏈霉素抗生物素蛋II6.4~6.6B蛋白濃度優(yōu)化優(yōu)化了pH值后，繼續(xù)優(yōu)化標(biāo)記的最低蛋白/抗

5、體濃度，也是采用梯度法，用不同濃度蛋白/抗體溶液與膠體金（已處于最佳pH環(huán)境）溶液混合后室溫放置15min,加入10%氯化鈉室溫放置2h,測(cè)定OD52o^o,以吸光值對(duì)蛋白/抗體濃度作圖，収線性趨勢(shì)線與橫軸交點(diǎn)的蛋白/抗體濃度為最小蛋白/抗體濃度。確定了最適pH及最小蛋白/抗體濃度后，可以開始進(jìn)行金標(biāo)記了。在調(diào)節(jié)好pH的膠體金溶液中邊迅速攪拌邊逐滴加入蛋白/抗體（濃度是之前確定的最小值的1.2倍），5min內(nèi)加完，再加入10%BSA至BSA終濃度為1%,攪拌10min。低溫超速離心去除未標(biāo)記蛋白/抗體及未充分標(biāo)記的膠體金，具體方法可參考：先1500rpm低速離心

6、1h去掉沉淀，然后15000rpm離心1h去掉上清，沉淀用含1%BSA的TBS溶解，重復(fù)高速離心三遍，得到可用于試紙條制備的金標(biāo)蛋白/抗體溶液。C參數(shù)優(yōu)化（部分條件優(yōu)化舉例）1樣品墊與金標(biāo)墊的組合優(yōu)化樣品墊處理液的pH設(shè)置三個(gè)梯度（7.2、&0、9.0）,金標(biāo)蛋白/抗體溶液設(shè)置三個(gè)稀釋倍數(shù)（1:1、1:2、1:3）制成金標(biāo)墊，交叉組合觀察加入陽性、陰性對(duì)照（生理鹽水）后的顯色情況（T線和C線均以1mg/mL的濃度包被）。顯色情況判定陰性均不顯色——陽性均顯色+（視顏色深淺定義級(jí)別）這里主要是對(duì)樣品墊處理液pH及金標(biāo)物質(zhì)的濃度進(jìn)行優(yōu)化，另外我們也可以對(duì)樣品墊和金標(biāo)

7、墊的處理液成分進(jìn)行優(yōu)化，這需要設(shè)計(jì)各種組合進(jìn)行測(cè)試。樣品墊吸收墊2T線、C線包被濃度優(yōu)化將要包被的抗體進(jìn)行1:1、1:2、1:3的稀釋，包被NC膜后經(jīng)陽性、陰性對(duì)照（生理鹽水）檢測(cè)觀察顯色情況，選擇最佳稀釋倍數(shù)（濃度）。將要包被的抗原進(jìn)行1:10、1:20、1:40、1:50、1:100的稀釋，抗體濃度采用上一步優(yōu)化的濃度，包被NC膜，經(jīng)陽性、陰性對(duì)照（生理鹽水）檢測(cè)觀察顯色情況，選擇最佳稀釋倍數(shù)（濃度）。當(dāng)然，我們也可以采用組合試驗(yàn)進(jìn)行二者包被濃度的優(yōu)化’3檢測(cè)墊封閉時(shí)間優(yōu)化檢測(cè)墊封閉時(shí)間設(shè)定lh、0.5h、lh、2h四個(gè)梯度，用之前優(yōu)化的參數(shù)組裝試紙條，加入

8、陽性、陰性對(duì)照（生理鹽水