蛇床子素對aβ2535誘導的星形膠質細胞nfκb活化機制的影響

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1、蛇床子素對AB2535誘導的星形膠質細胞NFkB活化機制的影響作者：程淑意，陳云波，王奇，梁偉雄,溫澤淮【摘要】【目的】探討蛇床子素(Osthole,Ost)拮抗B淀粉樣蛋白2535(A32535)毒性損傷、保護神經細胞的作用及其與核因子kB(NF訃)活化機制的關系?！痉椒ā恳栽囵B(yǎng)的大鼠星形膠質細胞(astrocytes,AS)為靶標建立阿爾茨海默病(Alzheimersdisease,AD)細胞模型。采用CCK8(cellcountingkit8)法檢測細胞活力，進行A32535造模濃度、時間以及Ost預處理最適宜濃度的選擇。經AB2535和Ost干預后，采用激光共聚焦顯微

2、鏡檢測分析異硫氤酸熒光素/碘化丙(FITC/PI)雙重標記的NFkB與其抑制蛋白(IkBa)在細胞內的激活程度,結合形態(tài)學觀察分析Ost對星形膠質細胞的保護作用?！窘Y果】Ost可拮抗A02535的神經毒性作用，尤其以低濃度(001?111mol/L)為佳，隨著濃度的升高，對細胞的保護作用呈減弱趨勢。40umol/L的AB2535作用于AS24h可過度活化NFkB的表達(P【關鍵詞】蛇床子素/藥理學；阿爾茨海默病/中藥療法;星形膠質細胞/病理學；細胞培蛇床子是傘形科一年生草本植物蛇床［Cnidiummonnieri(L)Cusson］的成熟果實，蛇床子素(osthole,Ost）是

3、從蛇床子中提取的一種天然香豆素。研究表明[15],Ost對機體多個系統(tǒng)均具有較好的作用，尤其在中樞神經系統(tǒng)方面，如改善學習記憶、抗衰老、鎮(zhèn)靜抗炎等。Ost防治疾病的作用機制以及核因子kB（nuclearfactorkappaB,NFkB）作為一種重要的核轉錄因子在此機制中所起的作用尚屬未知。本研究通過觀察Ost保護星形膠質細胞（astrocytes,AS）的作用及其與NFkB信號傳導通路之間的聯(lián)系，初步探討Ost在細胞學領域防治阿爾茨海默?。ˋlzheimersdisease,AD）的作用機制?，F(xiàn)將結果報道如下。1材料與方法11實驗動物新生24h內的SPF級SD大鼠由廣州中醫(yī)藥大

4、學實驗動物中心提供[合格證號：SCXK（粵）XX0001]o12主要試劑和儀器蛇床子素（購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110822XXO5）,0淀粉樣蛋白2535（AB2535）凍干粉（購自首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經生化室）,CCK8（cellcountingKit8）試劑盒（購自株式會社同仁化學研究所），高級DMEM（高糖）培養(yǎng)基（Gibco公司）,特級胎牛血清（Hyclone公司），胰蛋白酶粉末（Amresco公司），NFkBp65兔抗鼠抗體（Calbiochem公司），NFkB抑制蛋白（IKBa）兔抗鼠抗體仲山金橋公司），羊抗兔異硫氧酸熒光素（FITC）IgG（Invit

5、rogen公司），碘化丙噪（PI）和RNA酶A（Sigma公司）。AEG120型電子天平（日本島津）,WTB150型C02培養(yǎng)箱（德國Binder）,多功能自動酶標儀（瑞士Tecan）,德國Leica的倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡以及圖像分析軟件。13星形膠質細胞的培養(yǎng)和AD細胞模型的建立［6］本實驗室前期研究采用新生24h內的SPF級SD大鼠已成功建立了純化的原代星形膠質細胞（AS）體外培養(yǎng)技術，經鑒定其細胞純度達到95%以上。同時采用四甲基偶氮呼鹽（MTT）法檢測細胞毒性，實驗結果顯示,40umol/L的AB2535作用于純化培養(yǎng)的AS,能較好地模擬AD細胞病理損傷。14蛇床

6、子素對AD細胞模型活力的影響141AD細胞模型的建立將純化培養(yǎng)的AS接種到96孔板上，培養(yǎng)至細胞長滿孔底80%左右，吸棄舊的培養(yǎng)液,以終濃度為40umol/L的AB2535作用于星形膠質細胞24h后,倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化。XX年第27卷廣州中醫(yī)藥大學學報程淑意，等?蛇床子素對A32535誘導的星形膠質細胞NFkB活化機制的影響［1/2］第1期142蛇床子素對AD細胞模型活力的影響將純化培養(yǎng)的星形膠質細胞按25X104?3X104/孔的密度接種到96孔板中，并隨機分為7組：正常組，模型組，001Umol/LOst組，01limol/LOst組，1umo1/LOs

7、t組，10umol/LOst組，100Pmol/LOst組，6孑L/組。24h后倒置顯微鏡下見細胞長出突觸并呈相互融合狀態(tài)后，給Ost各濃度組加藥，分別于加藥后12、24、48h時，除正常組外，其他各組均加入終濃度為40Pmol/L的AB2535繼續(xù)培養(yǎng)24ho在所有實驗孔中加入CCK8液10uL,置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)lh,可見橙黃色結晶物(即甲月賛)形成，采用酶標儀測各孔吸光度(D)值，檢測波長為450nm。15NFkB和IkBa活性的檢測151實驗分組將純化培養(yǎng)的星形膠質細胞按