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《高糖對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞短期作用機(jī)制探討-(8396)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、10．5×TBE液Tris．HCl0．89mol／L硼酸0．89mol／LEDTAO．025mol／LpH8．3，高壓滅菌，應(yīng)用時(shí)稀釋至O．5xTBE液。11．6×RNA電泳負(fù)載液溴酚藍(lán)0．25％蔗糖40％12．2％瓊脂糖凝膠稱取0．79瓊脂糖，加入0．5XTBE液35ml，煮沸使瓊脂糖完全溶解，冷卻至60'C，加入10ul0．5mg／mlEB，補(bǔ)足水分至35ml。13．10×Ⅳ田OS：MOPS4．1889NaAe‘3H200．689ED呵A·2Na0．88969加雙蒸水溶解至100ml，調(diào)pn至7．014．Fura-2／AM(
2、2-[6．雙乙酸基-5-(2一雙乙酸氨基)一5-甲苯氧乙氧基】_2．苯駢呋喃．5一惡唑羥酸五鉀鹽)O．5mg，ura-2／AM溶解于5001al二甲基亞砜中，分裝后-20℃保存。15．10％TritonXq00(辛基苯基聚氧乙烯醚)取1mgTritonX-100溶解于10ml雙蒸水中，充分溶解后分裝．4℃保存。16．EGTA(乙二-醇雙(．氨基乙基)醚四乙酸)稱取1．909，用3mmol／L的Tris溶液配制成10ml(0．5mol／L)，分裝，412保存。四、注意事項(xiàng)1．所有溶液都用雙蒸水或三蒸水配制。2．所有涉及RNA的實(shí)驗(yàn)
3、，尤其在RNA抽提過(guò)程中所使用的器皿和溶液均需避免受核糖核酸酶污染。全部器皿和溶液使用前進(jìn)行高壓滅菌或過(guò)濾除菌，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中帶手套進(jìn)行操作。3．電泳槽使用前需經(jīng)O．I％SDS浸泡過(guò)夜，雙蒸水充分沖洗，晾干后使用。實(shí)驗(yàn)方法一、細(xì)胞培養(yǎng)和處理1．人臍帶靜脈內(nèi)皮繃胞原代培養(yǎng)參照史文舉等?的方法，取新鮮長(zhǎng)約35cm臍帶一根放入瓷盤中。于臍帶一端找到臍靜脈口，插入橡皮管并固定，用注射器抽取生理鹽水反復(fù)沖洗至無(wú)血，再吸50ml37"CPBS沖洗一次。然后灌入15ml0．5％胰酶，用止血鉗夾閉臍帶兩端，放入37℃水浴中消化20分鐘。放出酶液于離
4、心管中，加入含20％d、牛血清的199培養(yǎng)液終止反應(yīng)，用Hanks液沖洗兩次并收集于離心管中，1000rpm×10分鐘，棄上清。Hanks液洗滌細(xì)胞兩次，最后加入3ml含20％小牛血清的199培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。取9滴細(xì)胞懸液于離心管中，滴入1滴0．4％胎盼藍(lán)，混勻，靜置2分鐘，滴一滴染色的細(xì)胞懸液充滿記數(shù)板和蓋玻片間隙，然后在顯微鏡下記數(shù)。細(xì)胞數(shù)／ml=4大格細(xì)胞總數(shù)÷4X10'×稀釋倍數(shù)【2]．細(xì)胞記數(shù)為106并按種于25ml或50ml培養(yǎng)瓶中。放入37℃5％C02孵箱中培養(yǎng)。第二天換全液，以后每3天換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿瓶后
5、即可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。2．倒置顯徽髓下鑒定細(xì)胞[11細(xì)胞24小時(shí)完全貼壁，早期呈小多角形，以后逐漸變成短梭形，呈魚貫狀排列。鋪滿瓶時(shí)呈鋪路石狀“卵石征象”，單層無(wú)堆疊，出現(xiàn)接觸性生長(zhǎng)抑制，胞漿豐富，核圓形或橢圓形。3．原代臍帶尊脈內(nèi)皮細(xì)胞處理待細(xì)胞鋪滿至2／3瓶以上時(shí)，加無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)后換高濃度D．葡萄糖處理。實(shí)驗(yàn)分為兩組：(1)正常對(duì)照組：用5．56mmol／LD．葡萄糖處理6、12和24小時(shí)；(2)高糖組：用11．11mmol／L、16．67mmol／L和33．33mmol／LD．葡萄糖處理24小時(shí)，16．67mmo
6、l／LD．葡萄糖處理6、12和24小時(shí)。培養(yǎng)6、12和24小時(shí)后，收集培養(yǎng)液(．20℃貯藏)用于測(cè)定Ⅳ型膠原和層粘連蛋白。用0．02％EDTAlml和O．125％胰酶lml消化細(xì)胞10--20秒(貼壁細(xì)胞變圓)，倒出消化液。加入含20％小牛血清的199培養(yǎng)液5ml終止反應(yīng)，用彎頭吸管吹打細(xì)胞至脫落。吸出細(xì)胞懸液，1000rpmX10分鐘，棄上清，用含0．2％小牛血清白蛋白的D-Hanks液洗滌細(xì)胞兩次后測(cè)定細(xì)胞內(nèi)【Ca27i或用PBS洗滌細(xì)胞兩次后檢鍘TGF—p基因表達(dá)。二、血管內(nèi)皮細(xì)胞TGF-[B基因表達(dá)的檢涓1_細(xì)胞總RNA
7、的提取啪8吸細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)約3×107)入Eppendorf管
8、r4，500rpm×5rain4"CJr巍篙取上清，加入2001al變性液200pl飽和酚2001．d氯仿，異戊醇—，v=24，1)混勻Jr黧醺I棄異丙醇士沉淀加入lml95％7--,醇14，000rpmX10min4"C土真空干燥沉淀2．R．NA樣品的定量和電泳鑒定取151alDEPC處理雙蒸水溶解RNA沉淀，取5“l(fā)在紫外分光光度計(jì)上分別測(cè)定其260nm和280nmOD值。RNA純度：OD26c／OD280=1．89，RNA濃度=1．71ag／ixlⅢ。RNA
9、電泳：用水和I％SDS洗凈電泳槽和梳子，純乙醇擦洗干凈。3％H202浸泡2小時(shí)，再用DEPC處理的水清洗。把O．359瓊脂糖放人3．5ml10xMOPS溶液，加DEPC處理雙蒸水至35ml。在沸水中放置5分鐘至凝膠充分溶解，冷卻至50X2左右，加lOlal溴化乙
