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《體外誘導(dǎo)兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、體外誘導(dǎo)兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞摘要目的：通過密度梯度離心法分離兔骨髓基質(zhì)干細(xì)stromalstemcells，BMSCs)行體外培養(yǎng)，探討B(tài)MSCs體外培養(yǎng)后的生物學(xué)特性，并誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞方向分化，觀察其成骨過程。方法：用2％戊巴比妥鈉以30mg／蠔麻醉家兔后處死，分離雙側(cè)股骨、脛骨骨髓，利用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)分離純化兔BMSCs，制備單細(xì)胞懸液，接種于含10％胎牛血清的L．DMEM培養(yǎng)液中，通過傳代擴(kuò)增，進(jìn)一步去除未貼壁的細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿瓶底近80％后，加入0．25％胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。取生
2、長良好的對(duì)數(shù)期第3代細(xì)胞，以lxl07／L的細(xì)胞濃度接種于預(yù)置蓋玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為2組：實(shí)驗(yàn)組使用成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液，定向誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化；對(duì)照組等量加入含10％胎牛血清的L．DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。兩組細(xì)胞持續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞成骨分化觀察。主要觀察指標(biāo)：在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長及增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，I型膠原免疫組織化學(xué)染色，VONKOSSA染色和堿性磷酸酶染色檢測向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化情況，并作統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：用兔淋巴細(xì)胞分離液梯度離
3、心結(jié)合貼壁法從骨髓中分離單個(gè)核細(xì)胞，接種于含10％胎牛血清的L．DMEM培養(yǎng)液。在接種后48小時(shí)貼壁，細(xì)胞形態(tài)為橢圓形，多角形及短梭形；72小時(shí)后出現(xiàn)散在的紡錘狀貼壁細(xì)胞；10．14天后形成克隆。BMSCs貼壁稀疏時(shí)，長梭形細(xì)胞的兩極朝向不規(guī)則，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞之間往往通過突起相連接，約3周出現(xiàn)致密的貼壁細(xì)胞層，此時(shí)細(xì)胞的兩極開始有規(guī)律的排列成束狀，有的呈漩渦狀。經(jīng)傳代擴(kuò)增，細(xì)胞進(jìn)一步純化，細(xì)胞形態(tài)為均一的長梭形并呈漩渦狀排列，而且生長速率加快，P。代細(xì)胞群體倍增時(shí)間約為37小時(shí)。P。代細(xì)胞生長潛伏期為3．4天
4、，第4．6天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，2周后進(jìn)入平臺(tái)期。流式細(xì)胞儀檢測CD34，CD45陰性，CD44陽性。電鏡顯示BMSCs胞核呈類圓形或不規(guī)則型，核膜清晰，有1．2個(gè)核，染色質(zhì)較粗，胞質(zhì)中細(xì)胞器豐富，細(xì)胞表面有絨毛。用成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液定向誘導(dǎo)第3代BMSCs第7天，可觀察到少許細(xì)胞由梭形變?yōu)槎嘟切?。隨著時(shí)間的增長，多角形的細(xì)胞逐漸增多并聚集成團(tuán)，14天后VonKossa染色出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)，堿性磷酸酶染色呈陽性。對(duì)照組未見鈣化結(jié)節(jié)，堿性磷酸酶染色呈陰性。經(jīng)誘導(dǎo)后的細(xì)胞堿性磷酸酶染色明顯，胞質(zhì)中陽性反應(yīng)呈現(xiàn)灰黑色顆?；驂K狀沉淀，
5、堿性磷酸酶活性部位呈棕黑色。Vonkossa染色可見黑色的礦化結(jié)節(jié)顆粒，顆粒大小不均一，提示有礦化基質(zhì)沉積。骨誘導(dǎo)培養(yǎng)三周，免疫組化SP法可檢測到I型膠原表達(dá)，在結(jié)節(jié)周圍呈黃褐色，而對(duì)照組則未能表達(dá)。結(jié)論：(1)將兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)獲得大量較高純度的干細(xì)胞，且周期短，重復(fù)性好，可作為組織工程學(xué)中種子細(xì)胞的重要來源。(2)地塞米松在骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中所誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組在細(xì)胞在形態(tài)和生物學(xué)特性上都較對(duì)照組更具有成骨細(xì)胞的特征，其ALP得活性和形成鈣結(jié)節(jié)的能力都強(qiáng)于對(duì)照組細(xì)胞。(
6、3)BMSCs在體外適合的條標(biāo)件下可以向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并可檢測到標(biāo)志物表達(dá)的特異性。關(guān)鍵詞骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，成骨細(xì)胞，誘導(dǎo)分化窩囊。jbasispreparationforfutureresearchwork．Methods：Anesthetizedtherabbitswith2％pentobarbitalsodium30mg／kgdoseandkilledit．thenseparationbilateralfemurandtibiabonemarrow,usethewayofdensitygradientcent
7、rifugationcombinedwithadherentculture，purifiedrabbitBMSCs，preparationofsinglecellsuspensionandinoculatedwith10％fetalbovineserumL．DMEMculturemedium，throughthepassageamplified，andfurtherremovalofnon—adherentcells，whencellscoveredwiththebottomofbottlenearly80％，a
8、fteradding0．25％trypsindigestionandsubcultured．Takedthe3rdgenerationlogarithmicphasegrowwellcellsandinoculatedintopre··coverslipin24--wellplatewith1×107／Lcellconcentration．theexperimentalc
