兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的研究論文

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　　兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的研究論文李雅娜孫研張玲劉旭【摘要】目的探討兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞﹙bonemarroesenchymalstemcells,BMSCs﹚體外分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的方法，并研究其生物學(xué)特性。方法采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)自兔股骨、脛骨及肱骨中分離BMSCs進(jìn)行純化、培養(yǎng)。用地塞米松、β甘油磷酸鈉、維生素C定向誘導(dǎo)BMSCs分化為成骨細(xì)胞，改良MTT法測定其生長曲線，NBT/BCIP染色法、P對硝基苯基質(zhì)法及茜素紅染色法檢測BMSCs的成骨能力。結(jié)果成骨誘導(dǎo)1~5d，培養(yǎng)的細(xì)胞增殖旺盛，3~5d即可融合成單層，隨著誘導(dǎo)時間的延長，細(xì)胞增殖速度減慢.freelarroesenchymalstemcells﹙BMSCs﹚fromthebonemarrotodifferentiateintoosteoblastsinvitro.MethodsBMSCsthefemurs,tibiasandhumerusbonesoftherabbit,thenseparated,purifiedandproliferated.Afterprimaryculture,thesubculturedcellsediumincludingdexamethasone,βglycerophosphate,Lascorbicacid,thenstainedaryandpassagecultures.After8daysofosteoblastinducing,theBMSCscongregated,shoedmineralizednodule.Theexpressionofalkalinephosphataseitteddifferentiation.【Keyarroesenchymalstemcells,induceddifferentiation,osteoblasts由于腫瘤、外傷和骨骼異常等原因引起的大段骨缺損往往需要骨的重建，目前常規(guī)的方法有自體或異體、異種骨移植，但都存在一定的問題和限制，難以完全滿足臨床需要。組織工程化骨組織的研究為骨缺損修復(fù)開辟了新的途徑，但是在骨組織工程產(chǎn)品進(jìn)入臨床應(yīng)用前，尚存在一些障礙有待克服，其中如何獲得大量種子細(xì)胞是目前面臨的最關(guān)鍵性的制約因素。近年來干細(xì)胞尤其是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞﹙BMSCs﹚的研究為解決這一難題提供了可能。BMSCs是位于骨髓基質(zhì)中的一類中胚層來源的未分化細(xì)胞，具有很強的自我更新和多向分化潛能，在一定誘導(dǎo)條件下，可以分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和成肌細(xì)胞等，還可以分化為巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等骨髓基質(zhì)細(xì)胞，具有發(fā)育為骨、軟骨、脂肪、肌肉、真皮及骨髓基質(zhì)等中胚層組織的潛能［1~3］。此外，BMSCs具有取材容易，對機體損傷小，增殖力強，易穩(wěn)定表達(dá)成骨細(xì)胞表型等優(yōu)點，因此可作為骨組織工程的較好的種子材料。1材料與方法1.1材料1.1.1實驗動物：日本大耳兔12只，6~8周齡，雌雄不拘，體重（250±50）g，由昆明醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。 1.1.2試劑和藥品：LDMEM(GIBCO)，HEPES(CXBIO)，胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶（BBI），EDTA(CXBIO)，MTT(SIGMA)，三聯(lián)液（10％十二烷基硫酸鈉，5％異丁醇，0.012mol/L鹽酸），地塞米松（SIGMA），β甘油磷酸鈉（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所），維生素C（CXBIO），NBT/BCIP染色試劑盒（SIGMA公司），茜素紅（上海化學(xué)試劑廠），ALP（日本和光純藥工業(yè)株式會社）。1.2方法1.2.1BMSCs的分離、原代和傳代培養(yǎng)：耳緣靜脈注入少許空氣處死日本大耳兔，75%乙醇內(nèi)浸泡10min后，無菌條件下逐層切開皮膚及皮下組織，剝離附著于四肢長骨的肌肉，完整切取雙側(cè)股骨、脛骨和肱骨，PBS沖洗3遍；將各長骨兩側(cè)干骺端切除，充分顯露骨髓腔，用7號針頭的注射器吸取不含血清的LDMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，從長骨的另一端收集沖洗出來的骨髓，用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液，1000r/min離心5min，棄上清和脂肪，加入含20％FBS的LDMEM培養(yǎng)基吹打成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個/ml并接種于50ml培養(yǎng)瓶中，置于37℃，飽和濕度，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。12h后輕柔搖動培養(yǎng)瓶1次，使紅細(xì)胞從底壁上脫離；48h首次半量換液，棄去部分懸浮細(xì)胞；72h全換液，以后每2~3d根據(jù)培養(yǎng)基顏色全量換液。原代培養(yǎng)第8~12天，貼壁細(xì)胞逐漸開始融合并覆蓋培養(yǎng)瓶底面達(dá)80％以上，吸除培養(yǎng)基并用PBS洗滌貼壁細(xì)胞2次，加入025％胰蛋白酶和002%EDTA混合消化液2~3ml，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面。消化期間倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞收縮變圓，即將脫離瓶壁時，吸去消化液，立即用含10％FBS的LDMEM培養(yǎng)基終止消化。用彎頭吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)基，反復(fù)吹打貼壁細(xì)胞，吹打時動作要輕柔，盡可能不要出現(xiàn)泡沫，細(xì)胞脫壁后形成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液收集到離心管中，1000r/min離心5min，棄上清，加入含10％FBS的LDMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞重新打勻后，按1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。1.2.2定向誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化：第2、3、5代BMSCs長至80％融合后，常規(guī)傳代，細(xì)胞以1×104個/ml密度接種于放置有1cm×1cm蓋玻片的24孔板中，細(xì)胞達(dá)到80％融合后，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（LDMEM培養(yǎng)基，10％FBS，Dex10－8mol/L，βGP10mmol/L，VitC50mg/L，青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml，pH7.2）。對照組繼續(xù)加常規(guī)培養(yǎng)基，每3d換液一次。誘導(dǎo)期間倒置相差顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞生長、增殖情況及形態(tài)特征，并隨時拍照記錄。1.2.3 生長曲線測定：第3代BMSCs長至80％融合后，常規(guī)傳代，細(xì)胞以1×104個/ml密度接種于7塊96孔培養(yǎng)板，每孔90μl，每板接種16孔，細(xì)胞達(dá)到80％融合后，8孔更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，8孔繼續(xù)加常規(guī)培養(yǎng)基，每3d換液1次。從第2天起每隔24h取出一塊培養(yǎng)板，在成脂誘導(dǎo)孔和對照孔內(nèi)各加入10μlMTT（5mg/ml）溶液，置于37℃，飽和濕度，5％CO2孵箱培養(yǎng)4h后取出，每孔加入三聯(lián)液100μl，再次置于37℃，飽和濕度，5％CO2孵箱培養(yǎng)12h后取出。用酶標(biāo)檢測儀在570nm、630nm雙波長下測定各孔光密度（OD）值，連續(xù)測7次，取8個孔光密度的平均值，以時間（d）為橫坐標(biāo)，光密度（OD值，表示細(xì)胞相對數(shù)量）為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。1.2.4堿性磷酸酶﹙ALP﹚活性定性檢測（NBT/BCIP染色法）：分別于成骨誘導(dǎo)的第4、7、14天各取實驗組、對照組的細(xì)胞爬片PBS沖洗2次，用濾紙吸去多余水份，4％多聚甲醛固定30min，用NBT/BCIP試劑盒避光染色1h后，用流水沖洗，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。1.2.5堿性磷酸酶﹙ALP﹚活性定量檢測（P對硝基苯基質(zhì)法）：分別于成骨誘導(dǎo)的第4、7、14天，每孔加入少許0.25％胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液消化，再加入含10％FBS的LDMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液用超聲粉碎儀粉碎2min后800r/min離心8min，取上清液用全自動生化分析儀進(jìn)行ALP活性測定。1.2.6鈣結(jié)節(jié)檢測﹙茜素紅染色﹚：分別于成骨誘導(dǎo)的第4、7、14天各取實驗組、對照組的細(xì)胞爬片PBS沖洗2次，用濾紙吸去多余水份，95%乙醇固定20~30min，茜素紅染液中浸染5～10min后，用流水沖洗，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。2結(jié)果2.1BMSCs的原代及傳代培養(yǎng)原代、傳代細(xì)胞的形態(tài)相似，均有較強的增殖能力。原代培養(yǎng)細(xì)胞剛接種時，培養(yǎng)瓶中有大量懸浮細(xì)胞，24h后部分細(xì)胞開始貼壁伸展變形，剛貼壁的細(xì)胞單個排列，呈圓形或多角形，胞體透亮折光性強；48~72h后呈紡錘形或梭形，每個細(xì)胞形成一個集落，增殖迅速，集落之間相互靠近；培養(yǎng)4d后見貼壁生長的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)較大變化，可見成纖維樣細(xì)胞散布于培養(yǎng)瓶底，并有多個集落形成，細(xì)胞圍繞中心呈漩渦狀排列。5~8d期間集落逐漸增多，此后逐漸增大，并融合為單層。當(dāng)培養(yǎng)至第9~12d時，細(xì)胞已大部分融合，長滿瓶底，細(xì)胞成長梭形（成纖維樣外觀），有的細(xì)胞呈交叉重疊生長。原代細(xì)胞培養(yǎng)8~12d后，消化傳代，傳代細(xì)胞貼壁較快，剛傳代的細(xì)胞呈圓形。4h后可見明顯的貼壁細(xì)胞散在分布；24 h見貼壁細(xì)胞呈單層生長，伸展為短梭形、長梭形。原代培養(yǎng)局部區(qū)域存在少許小而圓的細(xì)胞，傳代后消失。第3代以后，細(xì)胞形態(tài)趨于一致。傳代細(xì)胞約5d基本長滿瓶底，細(xì)胞形態(tài)為成纖維細(xì)胞樣，見圖1、2。2.2BMSCs誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞的形態(tài)變化成骨誘導(dǎo)1~5d，培養(yǎng)的細(xì)胞增殖旺盛，3~5d即可融合成單層，細(xì)胞形態(tài)仍保持長梭形，實驗組與對照組無明顯差異。隨著誘導(dǎo)時間的延長，實驗組細(xì)胞增殖速度減慢，開始出現(xiàn)細(xì)胞聚集的現(xiàn)象，培養(yǎng)細(xì)胞逐漸匯合呈鋪路石狀，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，由梭形變?yōu)榘w較小的立方形，高倍鏡下可見細(xì)胞呈復(fù)層生長。繼續(xù)誘導(dǎo)，出現(xiàn)多角形成骨樣細(xì)胞，胞質(zhì)顏色變深，含粗大顆粒，胞核明顯，胞外基質(zhì)分泌逐漸增多，膠原堆積、鈣鹽沉積，10~12d形成不透光礦化結(jié)節(jié)，見圖3、4。圖3成骨誘導(dǎo)第8天，細(xì)胞重疊生長，出現(xiàn)細(xì)胞聚集的現(xiàn)象﹙×100﹚圖4成骨誘導(dǎo)第10天，形成不透光的鈣化結(jié)節(jié)﹙×100﹚2.3生長曲線分析﹙改良MTT法﹚第3代BMSCs的生長曲線見圖5。對照組生長曲線呈S形，傳代接種后第1、2天細(xì)胞增殖緩慢為潛伏適應(yīng)期，從第3天開始細(xì)胞增殖加速，細(xì)胞數(shù)目呈指數(shù)級遞增，此期為BMSCs的對數(shù)生長期。至第7天達(dá)到頂點。成骨誘導(dǎo)組與對照組第0天的光密度值（OD值）基本相同，隨著誘導(dǎo)時間延長，BMSCs在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，逐漸向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但BMSCs仍具有增殖能力，成骨生長曲線與對照組類似。圖5第3代BMSCs的生長曲線2.4堿性磷酸酶﹙ALP﹚活性定性檢測（NBT/BCIP染色法）成骨誘導(dǎo)第4天，成骨誘導(dǎo)組部分細(xì)胞染色出現(xiàn)淡藍(lán)紫色，成骨誘導(dǎo)第7天，大部分染色為強陽性，對照組有部分細(xì)胞染色為淡紫藍(lán)色，見圖6。A.對照組，堿性磷酸酶染色，呈陰性。B.成骨誘導(dǎo)組，堿性磷酸酶染色，呈強陽性。圖6成骨誘導(dǎo)第7天，堿性磷酸酶染色﹙×100﹚2.5堿性磷酸酶﹙ALP﹚活性定量檢測（P對硝基苯基質(zhì)法）各孔細(xì)胞經(jīng)消化、定容、超聲粉碎、離心后，取細(xì)胞上清液用全自動生化分析儀檢測ALP活性，結(jié)果如表1，圖7所示。表1不同時間細(xì)胞上清液ALP2.6鈣結(jié)節(jié)檢測﹙茜素紅染色﹚ 成骨誘導(dǎo)的第7天，成骨誘導(dǎo)組可見重疊生長的細(xì)胞逐漸形成結(jié)節(jié)狀，隨后膠原堆積及鈣鹽沉積，最后形成不透光礦化結(jié)節(jié)，茜素紅染色為棕紅色，而對照組未見鈣結(jié)節(jié)，茜素紅染色陰性，隨誘導(dǎo)時間延長，鈣結(jié)節(jié)明顯增多，見圖8。3討論BMSCs位于骨髓基質(zhì)中，在體外可以通過貼壁培養(yǎng)加以分離，分裂增殖能力強，可以向多種結(jié)締組織細(xì)胞﹙纖維、骨、軟骨、肌腱、肌肉、脂肪等﹚分化，并易于被外源基因轉(zhuǎn)染且穩(wěn)定表達(dá)，因此被認(rèn)為是組織工程理想的種子細(xì)胞、細(xì)胞及基因治療理想的靶細(xì)胞［４］。刺激BMSCs向成骨細(xì)胞分化的物質(zhì)很多［5，6］，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子β、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子、降鈣素等，其中以Dex、βGP和VitC聯(lián)合促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的方法最為常用。VitC是膠原中脯氨酸和賴氨酸末端羥基化的共同影響因子，能通過誘導(dǎo)成骨細(xì)胞特異性分化蛋白基因的表達(dá)來誘導(dǎo)ALP活性的增加。同時，VitC能增加鈣鹽的沉積和促進(jìn)鈣化骨結(jié)節(jié)的形成［7］。βGP可為成骨細(xì)胞的分化和增殖提供磷原子，能增加ALP的表達(dá)，促進(jìn)鈣鹽沉積，促進(jìn)鈣化［8］。Dex是BMSCs體外成骨的必需成分，體外培養(yǎng)的BMSCs只有加入Dex才能形成鈣化結(jié)節(jié)［9］。雖然Dex對BMSCs的增殖有抑制作用，但Dex在抑制BMSCs增殖的同時可明顯增加ALP的活性，Dex濃度越高作用越明顯［10］。堿性磷酸酶﹙alkalinephosphatase，ALP﹚是成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志，在體外鈣化中起關(guān)鍵性作用。目前認(rèn)為，ALP能夠水解有機磷酸酯，使局部PO43-濃度升高，并可破壞鈣化抑制劑，從而啟動鈣化，ALP活性越高，說明前成骨細(xì)胞向成熟成骨細(xì)胞分化越明顯。骨組織是通過骨基質(zhì)鈣化而形成，而骨基質(zhì)由成骨細(xì)胞所合成、分泌；在基質(zhì)開始鈣化時，成骨細(xì)胞的ALP活性最高，在鈣化接近結(jié)束時，活性則最低，其活力在一定程度上反映成骨細(xì)胞的分化程度和功能狀態(tài)［11］。本研究采用NBT/BCIP染色法、P對硝基苯基質(zhì)法及茜素紅染色的方法檢測BMSCs的成骨能力。NBT﹙硝基藍(lán)四氮唑﹚與SCIP﹙5溴4氯3吲哚磷酸鹽﹚是堿性磷酸酶最佳的底物組合之一，顯色反應(yīng)產(chǎn)物為藍(lán)色，不溶于水、乙醇及二甲苯。本研究選用了此染色方法，發(fā)現(xiàn)隨誘導(dǎo)時間的延長，染色由淡紫藍(lán)色變?yōu)樯钭纤{(lán)色，ALP的活性檢測也與之相符。礦化結(jié)節(jié)是鑒定成骨細(xì)胞及其功能的另一重要指標(biāo)，茜素紅染色可見鈣結(jié)節(jié)呈橘紅色或棕紅色。本實驗采用Dex、βGP和VitC聯(lián)合誘導(dǎo)的方法，作用5d后發(fā)現(xiàn)BMSCs形態(tài)由細(xì)長梭形逐漸變?yōu)槎嘟切魏头叫危?xì)胞外基質(zhì)分泌增多，細(xì)胞之間出現(xiàn)明顯的鈣化結(jié)節(jié)。ALP染色發(fā)現(xiàn)ALP表達(dá)陽性，茜素紅染色發(fā)現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)。證實了兔BMSCs能夠在Dex、βGP和Vit C聯(lián)合誘導(dǎo)下向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并且不影響細(xì)胞的增殖，可迅速大量地獲得細(xì)胞，為骨組織工程提供大量的種子細(xì)胞。兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞﹙BMSCs﹚在體外培養(yǎng)取材容易，對機體損傷小，增殖力強，經(jīng)多次傳代，細(xì)胞仍生長穩(wěn)定、增殖速度快、貼壁率高、適應(yīng)性強、接種成活率高，并且可以定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。因此，可作為骨組織工程的較好的種子材料?！?/p>