自體富血小板血漿體外培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并定向誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞的研究

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縮略詞mBMSCsCDD縮略詞表Abbreviation英文全稱中文全稱alkalinephosphatase堿性磷酸酶bonemarrowmesenchymalstemcells骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞clusterofdifferentiationopticaldensity抗原分化簇光密度DMEM．F12Dulbecco’SmodifiedEagle’s／DMEM-F12培養(yǎng)基DMSODOPCsFBSFCMFITCHEICCIOPCsMSCsMTTNBCSPASPBSPRPH鋤’S—F12mediunldimethylsulfoxidedeterminedosteogenicprecursorcellsfetalbovineserumflowcytometryfluoresceinisothiocyanatehematoxylinandeosinimmunocytochemicalstaininginducedosteogenicprecursorcellsmesenchymalstemcellsmethylthiazolyltetrazoliumnew-bomcalfserumperiodicacid—schiffphosphatebufferedsalineplatelet·richplasma二甲基亞砜定向性骨祖細(xì)胞胎牛血清流式細(xì)胞術(shù)異硫氰酸熒光素蘇木精．伊紅免疫細(xì)胞化學(xué)染色誘導(dǎo)性骨祖細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞四甲基偶氮唑藍(lán)新生牛血清過碘酸．希夫磷酸鹽緩沖液富血小板血漿Ⅲ3洲3¨i¨¨¨i●1㈣5Ⅲ4哪8¨¨ii■●-ⅢY 徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文自體富血小板血漿體外培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并定向誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞的研究中文摘要骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)具有多向分化潛能，是目前常用的骨組織工程種子細(xì)胞。研究表明移植的BMSCs數(shù)量越多，臨床療效越好。但BMSCs局部數(shù)量少，需經(jīng)過體外培養(yǎng)擴(kuò)增才能保證療效。當(dāng)前常以異種血清作為培養(yǎng)基，如胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)和新生牛血清(new-borncalfserum，NBCS)，若用于臨床，則存在倫理學(xué)爭議、傳播疾病和潛在抗原性等問題。富血小板血漿(platelet—richplasma，PRP)是自體全血提取物，可保證相對安全性，且含有多種生長因子。本實驗嘗試采用自體PRP替代異種血清體外培養(yǎng)兔BMSCs，觀察PRP對BMSCs體外增殖和誘導(dǎo)成骨分化的影響，探討促進(jìn)BMSCs的增殖和分化的新方法。第一部分自體富血小板血漿對兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖的影響目的用自體PRP體外培養(yǎng)兔BMSCs，探討PRP在BMSCs體外培養(yǎng)增殖時對細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。方法經(jīng)兔耳中央動脈取血，兩次離心法制備PRP。從兔髂骨穿刺抽取骨髓，密度梯度離心法富集BMSCs。將每只兔BMSCs分為PRP組、FBS組和無血清組，每組6例，分別采用10％自體PRP、10％FBS與無血清，配比DMEM．F12培養(yǎng)基和青、鏈霉素培養(yǎng)。觀察細(xì)胞形態(tài)變化、檢測各組細(xì)胞增殖活性并繪制生長曲線、細(xì)胞表型表達(dá)情況和堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性。2，．土=’?！?k 徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文結(jié)果3組細(xì)胞均在接種后24h左右開始貼壁，并由圓形逐步變化為長梭形、多角形和不規(guī)則形等。3組細(xì)胞均隨培養(yǎng)時間延長而增殖，生長曲線呈“S”形，PRP組與FBS組細(xì)胞生長迅速，明顯快于無血清組(PO．05)。成骨誘導(dǎo)10天，A、C組糖原染色和I型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色均呈陽性，B組細(xì)胞呈弱陽性，D組細(xì)胞呈陰性。成骨誘導(dǎo)14天，A、C組茜素紅S染色陽性，可見染成紅色的明顯鈣結(jié)節(jié)。結(jié)論自體PRP培養(yǎng)擴(kuò)增的BMSCs，在體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)下可定向分化為成骨細(xì)胞，并能夠穩(wěn)定表達(dá)成骨細(xì)胞的特異性表型。PRP能顯著增強(qiáng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)成骨的效能，但是PRP單獨(dú)使用不能將BMSCs誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞。、關(guān)鍵詞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；富血小板血漿；組織工程；成骨分化4‘▲ 徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文Thestudyofproliferationandinducingosteoblastofrabbitbonemarrowmesenchymalstemcellsculturedbyautologousplatelet·-richplasma／nvitroAbstractBonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs)werecapableofmultipledirectionaldifferentiationpotentiality,andwerecommonlyusedseedcellsofbonetissueengineeringcurrently．StudyshowedthemoreamountoftransplantedBMSCs，thebetterclinicaltherapeuticeffect．ButlocalquantityofBMSCswasfew,whichneedcultureandproliferationinvitroinordertoensuregoodtherapeuticeffect．Heterogeneousserumwascommonlyusedculturemediumcurrently,suchasfetalbovineserum(FBS)andnew．borncalfserum(NBCS)，whichmightbringethiccontroversy,transmitingdiseasesandcausingimmunologicalantigenicityproblemsandSOon．Platelet—richplasma(PRP)wasextractionfromautologouswholeblood，canensuresecurityrelativelyandcontainkindsofgrowthfactors．ThisexperimenttriedtoculturerabbitBMSCswithautologousPRPinsteadofheterogeneousseruminvitro，toobserveeffectsofPRPonproliferationandosteoinductiondifferentiationinvitro，andtodiscussanewmethodofpromotingofproliferationanddifferentiationofBMSCs．Part1Effectofproliferationofrabbitbonemarrowmesenchymalstemcellsculturedinautologousplatelet·richplasma／nvitroobjevtiveCulturerabbitBMSCsinautologousPRPinvitro，toexploreinfluenceofPRPonbiologicalcharacteristicsofBMSCsproliferationinvitro．MethodsHaemospasiafromrabbit’Searcentralartery,thenpreparePRPbytwo．stagecentrifugation．Puncturedandsampledbonemarrowfromrabbit’Siliacbone，andcollectedBMSCsthroughthemethodofdensitygradientcentrifugation．BMSCsofeveryrabbitweredividedintoPRPgroup，F(xiàn)BSgroupandserum-freecontrolgroup，5‘一 徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文with6subjectsforeachgroup，andseparatelyculturedin10％autologousPRP,10％FBSandserum—free，combinedwithDMEM—F12，penicillinandstreptomycin．Toobservecellsmorphology,detectproliferatingactivityanddrawgrowthcurve，cellssurfaceantigenandalkalinephosphatase(ALP)activityofeachgroup．ResultsAfterinoculationofrabbitBMSCsforabout24hours，cellsof3groupsadheredtowall，presentedroundandchangedintofusiform，polygonalandirregularformsgradually．BMSCsof3groupsproliferatedwhenculturedtimeextended，andthegrowthcurveswere“S”shape，cellsproliferatedrapidlybothinPRPandFBSgroupscomparedwiththeserum—freecontrolgroup(P0．05)．GlycogenandcollagenIimmunocytochemicalstainingofgroupAandCwerebothpositivewheninducedosteoblastfor10days，groupBshowedweaklypositiveandgroupDWasnegativehomeochronouslywheninducedosteoblastfor10days．OnlygroupAandCwerepositive，whichcouldbeseenobviouslyredcalciumnodusbyAlizarinredSstainingwheninducedosteoblastfor14days．ConclusionBMSCsproliferatedbyautologousPRP,couldbeosteoinducedtoosteoblastandstablyexpresseosteoblasticphenotype／nvitro．PRPcouldsignificantlyamplifythesynergisticeffectofosteoinduction，butcouldnotosteoinducedBMSCstoosteoblasticbehavebyuseitalone．KeywordsBMSCs；PRP；tissueengineering；osteoinduction7 徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文，1￡-．j_．翮吾脊柱手術(shù)中常利用骨移植來促進(jìn)脊柱融合和增強(qiáng)脊柱的穩(wěn)定性【11，傳統(tǒng)方法治療骨缺損、骨不連也大都需要進(jìn)行植骨處理。目前自體髂骨移植被廣泛應(yīng)用于臨床，但30％左右患者有供區(qū)慢性疼痛、血腫、傷口感染和神經(jīng)損傷等癥狀，而且增加術(shù)中失血及延長手術(shù)時間，并存在供移植的骨量不足、塑形困難等不利因素【21。異體骨移植存在誘發(fā)宿主產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)和傳播疾病(如HIV)的可能性【3訓(xùn)。因此，尋找具有良好生物學(xué)活性和強(qiáng)度的骨移植替代材料已成為研究的熱點(diǎn)。組織工程技術(shù)的發(fā)展為研制骨移植替代材料提供了新的途徑【51。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是骨髓中一種具有多向分化潛能的原始干細(xì)胞，體外可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，將BMSCs與恰當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合并應(yīng)用于臨床，可以獲得與自體骨移植相似，甚至更好的療效【61。BMSCs具有來源廣泛、取材方便、容易擴(kuò)增、易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)等優(yōu)勢【7母】，并能分泌多種成骨活性因子，為爬行替代、骨折愈合創(chuàng)造有利條件，被認(rèn)為是最好的骨組織工程種子細(xì)胞[101。‘目前對BMSCs的基礎(chǔ)研究，取得了令人鼓舞的成果[11-13】。但在組織工程應(yīng)用中受到諸多限制：第一，報道稱移植的BMSCs數(shù)量越多，臨床療效越好[14-15】，而局部BMSCs的數(shù)量較少，一般都需要經(jīng)過體外培養(yǎng)和擴(kuò)增；其數(shù)量才能達(dá)到組織工程應(yīng)用需求。第二，體外培養(yǎng)常以異種血清作為培養(yǎng)基，存在倫理學(xué)爭議、傳播疾病和潛在抗原性等問題[16-19】。所以BMSCs體外培養(yǎng)時若能使用自體血漿作為培養(yǎng)基，擴(kuò)增得到高濃度的BMSCs，再應(yīng)用于組織工程，既能提高治療的效率，同時又可以避免因異種血清培養(yǎng)帶來的倫理學(xué)爭議和致病性等問題。富血小板血漿(platelet—richplasma，PRP)是來源于自體血的血液制品，可保證相對安全性，由全血經(jīng)過離心、濃縮而得到，其特點(diǎn)是血小板濃度較高，且含有多種生長因子【20J。PRP中加入氯化鈣(CaCl2)和凝血酶，使其釋放出生長因子，R 徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文生長因子的含量與血小板的濃度呈正相關(guān)線形關(guān)系。PRP中主要的生長因子是血小板衍生生長因子(plateletderivedgrowthfactors，PDGFs)、類胰島素生長因子(insulin．1ikegrowthfactors，IGFs)和轉(zhuǎn)移生長因子一p(transforminggowthfactor-l}，TGF．D)等。自20世紀(jì)90年代開始，學(xué)者們對血小板中生長因子的生物學(xué)作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其具有誘導(dǎo)骨再生的作用，特別是濃縮的富血小板‘2¨。PI沖中的血小板能夠釋放大量的生長因子，從而促進(jìn)BMSCs的生長和增殖【22】。目前，PI心已應(yīng)用于創(chuàng)傷骨科、頜面外科和牙周外科等領(lǐng)域。盡管動物實驗和臨床初步應(yīng)用已證實PI廿有促進(jìn)骨組織再生的作用；然而關(guān)于體外條件下，單獨(dú)使用PI沖是否能夠直接誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化的報道較少。所謂體外成骨，是指將經(jīng)過純化和擴(kuò)增的BMSCs在一定的培養(yǎng)條件下，定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞，在培養(yǎng)皿上形成類骨組織即骨結(jié)節(jié)。PRP在骨修復(fù)和重建中的作用已被證實，而PRP促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的研究，也已成為骨組織工程研究的熱點(diǎn)。本實驗通過使用PRP體外培養(yǎng)擴(kuò)增BMSCs，再協(xié)同誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)BMSCs成骨分化。在誘導(dǎo)BMSCs成骨分化時，設(shè)立實驗對照組，僅僅使用PRP而不加入誘導(dǎo)因子，進(jìn)行較長時間培養(yǎng)(大于14天)，即使細(xì)胞達(dá)到100％融合，也不予以傳代，旨在研究單獨(dú)使用PRP能否誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。觀察BMSCs在體外增殖、分化過程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，MTT法檢測細(xì)胞增殖活性并繪制生長曲線，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面表型表達(dá)情況，檢測細(xì)胞堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)、糖原和I型膠原表達(dá)的變化，以及鈣結(jié)節(jié)形成情況。從而了解PI沖的生物學(xué)活性和誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化的時間，初步探討PRP在骨組織工程應(yīng)用中的意義，為進(jìn)一步研究PRP在骨組織工程中的作用機(jī)理及應(yīng)用價值提供實驗依據(jù)，為PRP整體動物實驗和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。9tq，、■r●■r ～I(xiàn)▲徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文，第一部分自體富血小板血漿對兔骨髓間充質(zhì)千細(xì)胞體外增殖的影響1材料1．1實驗動物材料和方法健康日本長耳大白兔10只，雌雄不限，部由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。1．2主要實驗耗材10ml離心管25cm2培養(yǎng)瓶6、24、96孔培養(yǎng)板載玻片、蓋玻片2001．tl、1000p1移液器槍頭1．3主要試劑優(yōu)質(zhì)胎牛血清PBS緩沖液DMEM．F12培養(yǎng)基胰蛋白酶凝血酶淋巴細(xì)胞分離液濾膜堿性磷酸酶檢測試劑盒10兔齡6～8個月，體重2．0"-'2．5公斤，全美國Coming公司徐州醫(yī)學(xué)院設(shè)備科提供杭州四季青公司北京中杉金橋生物公司美國Gibco公司美國Sigma公司天津灝洋生物公司華美生物工程公司南京建成生物公司 徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文一FITC標(biāo)記CD34、CD45、CD44和CD90抗體MTT試劑DMSO試劑Hoechst熒光染液1．4主要儀器YMT-Z型倒置顯微鏡LeicaDMR倒置熒光顯微鏡恒溫C02培養(yǎng)箱’LDZ5．2型離心機(jī)數(shù)碼照相機(jī)流式細(xì)胞儀HTS700型酶聯(lián)免疫檢測儀手提式壓力蒸汽滅菌器79．1型磁力熱攪拌器電熱恒溫水溫箱普通冰箱細(xì)胞計數(shù)板微量移液器恒溫振蕩器外科手術(shù)基本器械美國eBioseience公司美國Sigma公司江蘇碧云天公司日本Olympus公司德國Leica公司美國Forma公司北京醫(yī)用離心機(jī)廠日本Sony公司美國BD公司日本東芝公司上海華線醫(yī)用核子公司江蘇江陰科研器械廠北京醫(yī)療設(shè)備廠青島海爾公司上海求精生化試劑儀器公司法國Gilson公司江蘇太倉實驗設(shè)備廠華東醫(yī)療器械公司 徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文1．5主要試劑的配制1．5．1FIBS的分裝胎牛血清置于56。C恒溫水浴箱滅活30min，在無菌超凈臺中，將包裝為100ml的FBS用血清瓶分裝為20ml／瓶，．20℃保存?zhèn)溆谩?．5．2DMEM．F12培養(yǎng)基的配制(1L)干粉型DMEM-F12培養(yǎng)基一包(15．69)，溶于約800ml的雙蒸水中，再用雙蒸水洗包裝袋內(nèi)面兩次，倒入培養(yǎng)液中，以保證所有干粉都溶解成培養(yǎng)液。加入雙抗(100U／ml青霉素和100斗g／ml鏈霉素)。磁力攪拌器攪拌2h(不能加熱)，調(diào)節(jié)pH7．2～7．4，補(bǔ)加雙蒸水到1000mI。微孔濾膜(0．221．tm)過濾除菌，無菌分裝，-20*(2保存?zhèn)溆?。抽樣做無菌試驗。1．5．3PBS緩沖液的配制(2L)將PBS緩沖液粉劑倒入大燒杯中，用雙蒸水沖洗包裝袋兩次，并倒入燒杯中。用量筒加入2000ml雙蒸水，將燒杯置于磁力攪拌器上攪拌(可加熱)。微孔濾膜(O．221．tm)過濾除菌，無菌分裝，4"C保存?zhèn)溆谩?．5．4胰蛋白酶的配制(O．25％)稱取胰酶0．259放入燒杯，加入新鮮配制的PBSl00ml，冰浴中低速攪拌0．5h，調(diào)節(jié)pH7．2～7．4，微孔濾膜(0．22pm)過濾除菌，無菌分裝，一20。C保存?zhèn)溆谩?．5．5MTT的配制用PBS溶解，配成終濃度59／L的溶液，．20。C避光保存?zhèn)溆谩?．5．610％中性緩沖福爾馬林的配制Na2HP04’12H：O6．59NaHEP044．0940％福爾馬林100ml雙蒸水至1000ml12 徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文2實驗方法2．1兔自體PRP的制備從兔耳中央動脈抽血8．0ml(預(yù)先加入10％枸櫞酸鈉抗凝劑)，無菌條件下采用二次離心法制備PRP：第·次，室溫下2400r／min離心10min，吸取上層血漿及血小板，轉(zhuǎn)移到另一個無菌離心管內(nèi)；第二次，室溫下3600r／min離心15min，棄上層血漿，將剩余液體與激活劑(100U／ml凝血酶與lO％CaCl2的混合物)以9：l比例混合，振蕩，4"C冰箱過夜，讓血液凝固。血凝塊充分收縮后1000r／min離心10min，吸取全部上清液，即為PRP，約O．5mL，微孔濾膜(O．22I-tm)過濾除菌，做好兔來源標(biāo)記，．20"C保存?zhèn)溆??！?．2BMSCs的分離取6只日本長耳大白兔(雌雄不限)稱重，耳緣靜脈3％戊巴比妥鈉(1ml／kg)麻醉。雙側(cè)髂后部剃毛，消毒，鋪無菌巾。穿刺前先將穿刺針及注射器肝素化，用16號骨髓穿刺針在髂后上棘穿刺抽取骨髓約8ml，放入含有肝素(每lml骨髓加入1000U肝素抗凝)的無菌試管內(nèi)，并加入等體積肝素化(1000U／m1)的PBS緩沖液，混勻后將細(xì)胞懸液緩慢注入到裝有3ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管內(nèi)，利用密度梯度離心原理對骨髓懸液中干細(xì)胞進(jìn)行分離(3000r／min，8min)，小心吸取交界處的白膜層(即單個核細(xì)胞層)，用PBS緩沖液洗滌兩次(1500r／min，5min)。包扎兔穿刺傷口，術(shù)后肌注青霉素80萬U／次，1次／天，3,--,5天。2．3BMSCs的培養(yǎng)將上述洗滌后的細(xì)胞分別接種于6個6孔板中并做好標(biāo)記，每個板使用三個．孔，每個孔對應(yīng)使用一種培養(yǎng)方法。PRP組采用培養(yǎng)基為干細(xì)胞來源個體的自體10％PRP配比DMEM，F(xiàn)12培養(yǎng)基；FBS組采用培養(yǎng)基為10％FBS配比DMEM-F12培養(yǎng)基；無血清組僅采用DMEM．F12培養(yǎng)基，各組培養(yǎng)基均含lOOU／ml青霉素和100“g／L鏈霉素。細(xì)胞放入37"C，5％C02飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中，并標(biāo)記為原代細(xì)胞(Po)。 徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文2．4BMSCs的換液準(zhǔn)備好實驗試劑和器材，包括細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基、PBS液、離心管和吸管各若干，在無菌超凈臺中操作。按照分組情況對培養(yǎng)板上不同孔內(nèi)的細(xì)胞更換相應(yīng)的培養(yǎng)基。放入37℃，5％C02飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中，做好時間標(biāo)記。2．5BMSCs的傳代準(zhǔn)備好實驗試劑和器材。將融合達(dá)90％的細(xì)胞中的培養(yǎng)基吸棄，加入少量胰酶，鏡下觀察細(xì)胞消化情況，及時中止消化，離心收集細(xì)胞(1500r／min，5min)。棄去離心后的上清，加入少量培養(yǎng)基，吹打沉淀以形成單細(xì)胞懸液。檢測細(xì)胞活力后計數(shù)傳代，按照原培養(yǎng)方法分別加入3種不同培養(yǎng)基。2．6BMSCs爬片方法24孔培養(yǎng)板中，每孔放入1張小玻片，將細(xì)胞用相應(yīng)的培養(yǎng)基稀釋為lxl04／ml，每孔lml接種于24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)液，PBS沖洗，10％中性緩沖福爾馬林固定，用中性樹脂將小玻片粘于載玻片上，玻片晾干，用于HE染色、Hoechst熒光染色及免疫細(xì)胞化學(xué)染色等實驗。3細(xì)胞觀察和實驗檢測方法3．1BMSCs形態(tài)學(xué)觀察原代及傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，用倒置顯微鏡逐日觀察細(xì)胞的生長、增殖情況及形態(tài)學(xué)特征。取出傳代培養(yǎng)時制備好的細(xì)胞爬片小玻片，分別做HE染色和Hoechst熒光染色，鏡下觀察并拍照。3．1．1HE染色方法蘇木素浸染5min，自來水沖洗，以洗去蘇木素和浮色，1％鹽酸乙醇分化，使切片褪色至淡蘭紅色即可；流水洗滌3min；伊紅液浸染2min；自來水沖洗，以洗去伊紅浮液，并用紗布擦凈玻片上的多余染料；50％，60％，70％，80％，90％，100％乙醇梯度脫水，每個梯度5min；二甲苯透明5minx2次；中性樹脂封片，鏡下觀察并拍照。14 徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文3．1．2‘Hoechst熒光染色方法(1)制備染色液：將10ttgHoechst粉劑溶于lml雙蒸水中；(2)細(xì)胞爬片上加少量染色液，覆蓋細(xì)胞表面，室溫放置3---5rain；(3)吸盡染色液，PBS洗片，5minx3次；(4)立即熒光顯微鏡下觀察并拍照，實驗及拍照過程注意避光。3．2BMSCs增殖測定(MTT法)并繪制生長曲線取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度以每孔lxl04個細(xì)胞接種于96孔板，每組細(xì)胞接種48孔，置于37。C，5％C02飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日起每天選擇6孔細(xì)胞，每孔加入MTT溶液20止，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，棄上清。每孑L：Jn150ttlDMSO，室溫振蕩10min使細(xì)胞成分裂解，并且使沉淀物充分融解。酶聯(lián)免疫檢測儀570nm波長處測定每孔光密度值(D570)，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，D570值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。3．3BMSCs細(xì)胞表型分析r取生長狀態(tài)良好的第4代細(xì)胞，胰酶消化后收集細(xì)胞，每管lxl06個細(xì)胞，分別加入FITC標(biāo)記的CD34、CD44、CD45和CD90抗體，常溫暗室孵育半小時，PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞CD34、CD44、CD45和CD90表達(dá)情況。3．4BMSCsALP活性測定分別收集3組第1～5代細(xì)胞，每代lxl05個細(xì)胞，離心棄上清，加入600lxl2％TritonX．100震蕩30s，44C冰箱過夜裂解，儲存于．20℃冰箱待檢，共計90個樣本。細(xì)胞ALP活性檢測參照試劑說明進(jìn)行(表1)。 峰l▲徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文表1BMSCsALP活性檢測操作表測定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管BMSCs細(xì)胞裂解液(m1)O．05O．1mg／ml酚標(biāo)準(zhǔn)液(m1)O．05雙蒸水(m1)O．05緩沖液(m1)0．5O．50．5基質(zhì)液(m1)O．50．5充分混勻37℃水浴15min顯色劑(m1)1．5立即混勻，520nm波長，0．5cm光徑比色，空白管調(diào)零，測每管光密度值(D520)ALP活性(U／100m1)計算公式=(測定管D520值／標(biāo)準(zhǔn)管D520值)×標(biāo)準(zhǔn)管含酚的量(O．005rag)×(100mI／0．05m1)4統(tǒng)計學(xué)處理用SPSSl6．0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用抽表示，多個樣本均數(shù)比較采用方差分析。P<0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。16 徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文lBMSCs形態(tài)學(xué)觀察1．1BMSCs倒置顯微鏡觀察結(jié)果3組原代細(xì)胞均在接種后24h左右開始呈半貼壁生長，48h后基本完全貼壁，呈扁平狀(圖la)。72h后細(xì)胞呈紡錘狀，加入新鮮培養(yǎng)基后，細(xì)胞逐漸伸出偽足，變成多角形和梭形(圖Ib)，可見PRP組和FBS組細(xì)胞生長迅速，明顯快于無血清組。7天后逐漸形成集落，由數(shù)十個細(xì)胞融合而成，細(xì)胞按一定的方向排列，呈漩渦狀，形如成纖維細(xì)胞(圖le)。PRP組和FBS組原代細(xì)胞培養(yǎng)10天左右，細(xì)胞融合面積可達(dá)80～100％(圖ld)，無血清組細(xì)胞需15天左右才能達(dá)到該融合狀態(tài)，且有細(xì)胞脫片現(xiàn)象(圖le)。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)90％時予以傳代擴(kuò)增，此時細(xì)胞增殖旺盛，PRP組和FBS組細(xì)胞培養(yǎng)5---7天即可完全融合，鋪滿培養(yǎng)板的底面，細(xì)胞形態(tài)較為均一(圖lf)。而無血清組細(xì)胞脫片較多，需7---9天才能傳代。從每次傳代所需時間看，PRP組細(xì)胞生長迅速，傳代時間最短，細(xì)胞增殖明顯快于FBS組和無血清組。1．2BMSCs染色觀察第2代細(xì)胞傳代培養(yǎng)時，制備細(xì)胞爬片，分別做HE染色(圖2a、2b)和Hoechst熒光染色(圖3a、3b)，鏡下觀察可見BMSCs核漿分明，其多角形、長梭形形態(tài)更加明顯，細(xì)胞偽足也清晰可見。2BMSCs增殖情況測定3組細(xì)胞均隨時間延長而增殖，PRP組與FBS組細(xì)胞O～2天為生長潛伏期，3---5天細(xì)胞生長活躍，呈指數(shù)級遞增，為對數(shù)生長期，此后細(xì)胞增殖減緩進(jìn)入平臺期，生長曲線呈“S”形；無血清組細(xì)胞增殖緩慢，第4天起呈對數(shù)生長，至第7天達(dá)高峰，之后為平臺期。從第3天起，PRP組與FBS組細(xì)胞生長迅速，明顯快于無血清組(PO．05)，但均顯著高于同代次FBS組和無血清組細(xì)胞ALP活性(尸O．05)(表3，圖6)。18l2345678 ▲徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文表3第1代至第5代3組BMSC$ALP活性(露=6，夏虹，U／lOOml)ALP活性細(xì)胞代數(shù)PRP組FBS組無血清組14．27j=0．744．62．士0．894．36士1．1224．70-a：O．7635．65+0．9646．42+0．89+57．02+0．92’4．52士1．114．60-a：0．99‘4．94土：1．024．33士1．284．61士1．064．37士1．094．78士O．914．52士0．93與PRP組第l～2代相比：．尸<0．01；與FBS組及無血清同代次相比：．P0．05)(表4，圖11)。表4第5代誘導(dǎo)培養(yǎng)4組BMSC$ALP活性測定結(jié)果(刀=6，商U／100mi)培養(yǎng)時間(天)ALP活性A組B組C組D組46810128．80士O．657．154-0．83#8．18+0．8411．16士O．867．80-a=0．88撐10．27=1=1．2814．08+1．188．224-0．84幫13．39+1．2017．314-1．318．684-1．11撐15．47士1．1718．13=t=1．158．80-J=0．94#16．96士1．204．93士0．64·△5．09士0．59簟△5．06士0．87·△5．39生O．7l·△5．33+0．77·△與A、B、C組同時間點(diǎn)相比：．P40mg／100m1)時，便可使類骨質(zhì)鈣化。(爹骨膠原纖維在胞外形成過程中作為結(jié)晶物，起著對骨鹽沉積的誘導(dǎo)作用【461。研究表明BMSCs體外誘導(dǎo)成骨過程，主要經(jīng)歷了以下幾個階段：細(xì)胞轉(zhuǎn)化期、細(xì)胞增殖期、細(xì)胞聚集分泌期、細(xì)胞外基質(zhì)鈣化期，在分化過程中可以觀察到BMSCs逐漸轉(zhuǎn)變成具有成骨細(xì)胞形態(tài)特征和生物活性的細(xì)胞，早期出現(xiàn)的ALP、糖原和I型膠原等，晚期出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)。芻．．ALP是一種細(xì)胞內(nèi)酶，是成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志物，其活性在細(xì)胞誘導(dǎo)早期即開始出現(xiàn)，是出現(xiàn)最早的成骨性標(biāo)志，并且有時間依賴性，隨著誘導(dǎo)時間延長而．增加，并與細(xì)胞的成骨分化成熟呈正相關(guān)，鈣化期達(dá)高峰【471。因此可以作為判斷成骨細(xì)胞功能狀態(tài)的一個重要指標(biāo)，用來衡量BMSCs向成骨細(xì)胞分化的程度。實驗中測定細(xì)胞內(nèi)ALP活性時發(fā)現(xiàn)，PRP誘導(dǎo)組和FBS誘導(dǎo)組細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的延長，ALP活性從較低水平逐漸升高，12天后趨于穩(wěn)定，這說明BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后向成骨細(xì)胞分化良好。I型膠原是構(gòu)成骨基質(zhì)的主要成分，它能通過蛋白激酶使靶蛋白磷酸化，增加細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，另外可活化Na十／H十交換系統(tǒng)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的粘附、增殖和分化，并可促進(jìn)新骨形成146，481。本實驗通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測細(xì)胞內(nèi)I型膠原 徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)經(jīng)成骨誘導(dǎo)lO天后，細(xì)胞I型膠原呈陽性表達(dá)。∥目前，BMSCs的鑒定是通過綜合一系列的表型、形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能特性來完成[241。本實驗采用二陽(CD44和CD90)和二陰(CD34和CD45)的BMSCs表面標(biāo)記分子對體外培養(yǎng)的BMSCs進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)PRP組和FBS組第4代細(xì)胞CD44和CD90均呈陽性，表達(dá)在80％以上；CD34和CD45均呈陰，表達(dá)低于20％，說明BMSCs傳至第4代時，細(xì)胞中仍有少量造血系統(tǒng)的干細(xì)胞。第4代BMSCs成骨誘導(dǎo)5天后，收集誘導(dǎo)的BMSCs流式細(xì)胞術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞表面標(biāo)記CD44和CD90均呈陽性，表達(dá)在96％以上；CD34和CD45均呈陰性，表達(dá)低于10％。說明本實驗中BMSCs經(jīng)過5天的誘導(dǎo)培養(yǎng)，其純度進(jìn)一步得到純化，但成骨分化程度較低，仍然主要表達(dá)BMSCs的表型。本實驗將細(xì)胞分為四組，采用10％體積分?jǐn)?shù)的自體PRP、誘導(dǎo)因子的DMEM．F12，作為誘導(dǎo)培養(yǎng)實驗組的培養(yǎng)基；以含10％體積分?jǐn)?shù)FBS、誘導(dǎo)因子的DMEM—F12，作為誘導(dǎo)培養(yǎng)對照組的培養(yǎng)基；另外兩組為對照組，分別單獨(dú)使用PRP和FBS，配比DMEM．F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。實驗發(fā)現(xiàn)PRP誘導(dǎo)組及FBS誘導(dǎo)組細(xì)胞在形態(tài)學(xué)變化、ALP活性、細(xì)胞表型：表達(dá)、細(xì)胞I型膠原表達(dá)、糖原染色和茜素紅S鈣結(jié)節(jié)染色等各個方面的觀察和檢測中，均呈陽性變化，且PRP誘導(dǎo)組陽性變化最強(qiáng)；而單獨(dú)PRP培養(yǎng)對照組及FBS培養(yǎng)對照組結(jié)果與前兩組相反，表達(dá)為陰性或弱陽性變化。說明PRP能顯著增強(qiáng)化學(xué)藥物誘導(dǎo)成骨分化的效果。本實驗中持續(xù)單獨(dú)使用PRP培養(yǎng)細(xì)胞長達(dá)15天，沒有觀察到BMSCs向成骨細(xì)胞分化的形態(tài)學(xué)變化，指標(biāo)檢測中ALP活性較兩誘導(dǎo)組明顯偏低(P<0．01)，但比FBS對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(尸．弓《△一《圖5第4代PRP組BMSCs表型流式鑒定結(jié)果CD44和CD90表達(dá)均呈陽性，CD34和CD45表達(dá)均呈陰性1086420P1P2P3P4P5Passagetimes圖6第1"---5代PRP組、FBS組和無血清組BMSCsALP活性與FBS組和無血清組相比：≯