骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈移植對(duì)腦梗死大鼠治療作用的研究

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1、中文摘要骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈移植對(duì)腦梗死大鼠治療作用的研究摘要目的：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BoneMarrowMesenchymalStemCells，BMSCs)體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增；B．巰基乙醇體外誘導(dǎo)其向神經(jīng)組織分化，電鏡及免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定分化細(xì)胞方向；Longa改良線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MiddleCerebralArteryOcclusion，MCAO)模型，觀察第4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈移植對(duì)成模大鼠的治療效果；明確骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否可經(jīng)血液循環(huán)歸巢至受損腦區(qū)；是否可在腦內(nèi)存活、遷移、并

2、向神經(jīng)組織分化；是否促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nervegrowthfactor，NGF)、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Brain．drivedneurotrophicfactor，BDNF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)的分泌；是否減少腦缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞凋亡。以此探討B(tài)MSCs的生物學(xué)特性及靜脈移植治療大鼠腦梗死的效果和機(jī)制。方法：1取3～4周齡的健康雄性SD大鼠，采用percoll密度梯度離心法結(jié)合貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs，傳代擴(kuò)增，取第4代細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，

3、倒置相差顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。2按照Woodbury方案進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)和誘導(dǎo)。L．DMEM培養(yǎng)基+lmmol／LB．巰基乙醇+20％FBS預(yù)誘導(dǎo)24小時(shí)后，L．DMEM+5mmol／LB．巰基乙醇誘導(dǎo)5小時(shí)，之后去除誘導(dǎo)中文摘要液為常規(guī)培養(yǎng)基，再培養(yǎng)2周?！?誘導(dǎo)后進(jìn)行細(xì)胞鑒定：倒置相差顯微鏡下觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變；免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)前體細(xì)胞表面標(biāo)志(神經(jīng)上皮巢蛋白nestin)、神經(jīng)元細(xì)胞表面標(biāo)志(神經(jīng)元特異性烯醇化酶neuronspecificenolase，NSE

4、)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志(膠質(zhì)纖維酸性蛋白glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)的鑒定。4第3代BMSCs傳代、換液后進(jìn)行Brdu標(biāo)記，時(shí)間大約3天，待第4代細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底時(shí)收集細(xì)胞，待移植。5健康雄性成年SD大鼠(3月齡，體重270．3009)，Longa改良線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(MiddleCerebralArteryOcclusion，MCAO)模型。取成模大鼠50只隨機(jī)分成兩組，BMSCs移植組和PBS對(duì)照組，每組25只。6于MCAO24h后，將Brdu標(biāo)記的第4代B

5、MSCs細(xì)胞lmL(含3x106個(gè)細(xì)胞)從尾靜脈植入BMSCs組大鼠，對(duì)照組同樣途徑給予等量PBS。于MCAO后1天(移植前)、移植后7、14、21天各組大鼠分別進(jìn)行改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(modifiedNeurologicalSeverityScores，mNSS)；移植術(shù)后7天，各組大鼠分別隨機(jī)取5只進(jìn)行TTC染色測(cè)定梗死體積；再于同一天和第14、21、28天兩組各處死大鼠5只，灌注取腦，多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作石蠟切片。分別行HE染色觀察腦缺血病理改變；TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡

6、；免疫組織化學(xué)染色鑒定移植入腦的BMSCs及分化以及NGF、BDNF、VEGF等因子的分泌。7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理中文摘要實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立EXCEL數(shù)據(jù)庫(kù)，資料采用SPSSll．5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。兩組間同一時(shí)間點(diǎn)樣本均數(shù)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)組間均數(shù)之間采用單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(i土S)表示，以P

7、態(tài)。傳代后，細(xì)胞形態(tài)逐漸純化，至第4代，形態(tài)單一，呈長(zhǎng)梭形，漩渦狀和平行排列生長(zhǎng)。2預(yù)誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，加入誘導(dǎo)液后細(xì)胞形態(tài)迅速改變，誘導(dǎo)5小時(shí)部分細(xì)胞漂浮、崩解、死亡，細(xì)胞形態(tài)不再發(fā)生明顯改變，大部分細(xì)胞呈現(xiàn)神經(jīng)元樣形態(tài)。之后用常規(guī)培養(yǎng)基替換誘導(dǎo)液，一周以后，大多數(shù)細(xì)胞仍為神經(jīng)元樣形態(tài)，第2周細(xì)胞形態(tài)緩慢改變，2周時(shí)，細(xì)胞形態(tài)逐漸回到誘導(dǎo)前扁平的梭形狀態(tài)。3誘導(dǎo)后細(xì)胞神經(jīng)標(biāo)志物的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示：空白對(duì)照組Nestin、NSE、GFAP均無(wú)表達(dá)。其余組，GFAP均為陰性。預(yù)誘導(dǎo)組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞表

8、達(dá)，Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在誘導(dǎo)1h后達(dá)到高峰，約為29．35％，誘導(dǎo)5h時(shí)幾乎測(cè)不到。NSE陽(yáng)性細(xì)胞率隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸提高，誘導(dǎo)5h時(shí)NSE的陽(yáng)性率約為57．53％。Nestin、NSE兩個(gè)指標(biāo)預(yù)誘導(dǎo)24h，誘導(dǎo)1h，誘導(dǎo)5h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞率比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P