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《靶向糖基轉(zhuǎn)移酶shrna表達(dá)質(zhì)粒對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和遷移能力的抑制作用》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、Ill／lll／lll／IIII／llllllIlU／fllllll769883糖蛋白廣泛存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞間質(zhì)中，由寡糖和蛋白質(zhì)以共價(jià)方式連接而成。絕大多數(shù)寡糖是其相應(yīng)的糖蛋白的功能中心，在細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)傳遞中起關(guān)鍵作用。糖鏈的形式有多種，其中N．糖鏈的結(jié)構(gòu)改變足細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟。多數(shù)研究證明在腫瘤細(xì)胞巾，常發(fā)現(xiàn)糖蛋白結(jié)構(gòu)的異常增加，出現(xiàn)了腫瘤組織“異常糖基化”。發(fā)生這種變化的具體機(jī)制尚不清楚，但在大多數(shù)情況下，糖基轉(zhuǎn)移酶的激活起著主要的作用。糖基轉(zhuǎn)移酶在糖蛋白的合成中起關(guān)鍵作用。N．乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶分布于高爾基體，
2、其主要功能是在核心五糖基礎(chǔ)上形成多分支結(jié)構(gòu)，將供體底物UDP．N．乙酰氨基葡萄糖(UDP．GlcNAc)中的GlcNAc(Gn)糖基轉(zhuǎn)移至N．聚糖五糖核心的兩個(gè)甘露糖。N．乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶至少有6種，其中N．乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V(N-acetylglucosaminyltransferaseV，GnT-V)是目前研究最多的。在正常體內(nèi)，GnT-V是參與N．糖鏈生物合成的酶類，是糖蛋白N．糖鏈加工酶之一，具有決定N．糖鏈類型及復(fù)雜型糖鏈結(jié)構(gòu)的重要作用。在高爾基體內(nèi)催化形成N．糖鏈的Bl，6分支，將核糖體合成的蛋白進(jìn)行糖基化修
3、飾。在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞表面出現(xiàn)分子量更大的糖鏈，主要就是GIlT-V高表達(dá)引起N．糖鏈13l，6分支增加，GlcNAc131,6ManQ1,6結(jié)構(gòu)有利于外鏈的延伸，可進(jìn)一步合成N．乙酰氨基乳糖重復(fù)順序。己發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的轉(zhuǎn)移有密切RNAi技術(shù)是指在生物體細(xì)胞中，外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA(double2strandedRNA，dsRNA)引起與其同源mRNA的特異性降解，而抑制其相應(yīng)基因表達(dá)的過程。RNA干擾具有高效性，穩(wěn)定性，特異性等優(yōu)點(diǎn)，它選擇性地沉默腫瘤細(xì)胞內(nèi)的癌基因和抑癌基因，抑制其功能表達(dá)，分析其
4、表型的改變，有利于揭示腫瘤發(fā)生與病變的分子機(jī)制，從而為腫瘤的診斷和治療提供治療靶點(diǎn)。本課題旨在利用RNA干擾技術(shù)，將靶向針對(duì)GnT-V的shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)肝癌細(xì)胞，用cck．8增殖實(shí)驗(yàn)，劃痕實(shí)驗(yàn)，趨化運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)以及體內(nèi)皮下成瘤實(shí)驗(yàn)來觀察肝癌細(xì)胞增殖和遷移能力的改變，為肝癌分子靶向治療研究中新靶標(biāo)的確定提供客觀依據(jù)。二、研究目的將靶向針對(duì)高表達(dá)基因GnT-V的shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)人肝癌HepG2細(xì)胞，觀察GnT-V的表達(dá)變化對(duì)HepG2細(xì)胞體外及體內(nèi)增殖和遷移能力的影響，為肝癌分子靶向治療研究中新靶標(biāo)的確定提供客觀依據(jù)。三、實(shí)
5、驗(yàn)方法1、pGPU6／GFP／NeoGnT-VshRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定已由本課題組成員賀Ⅱ碩士學(xué)位論文富麗完成，方法如下：a．GnT-VsiRNA序列的設(shè)計(jì)：按照siRNA設(shè)計(jì)原則，利用Ambion公司提供的“siRNATargetFinderandDesignTools”，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中GnT-V基因(NM002410．3)cDNA，設(shè)計(jì)針對(duì)GnT-VcDNA的RNA片段，序列分別如下：sense5’GGAAGTGCATGCAACTGTTl’A37，sense57CTCCTTTGACCCTAAG—釓盯37。分別命名為G
6、nT_V／1564和GnT-V／2224。將其中一對(duì)的序列打亂排列，經(jīng)Blast比對(duì)，無任何同源性超過70％的序列，作為陰性對(duì)照干擾序列，序列如下：sense57GTTCTCCGAACGTGTCACGT37，命名為GnT-V／NC。b．shRNA轉(zhuǎn)錄模板DNA的設(shè)計(jì)：根據(jù)前面設(shè)計(jì)的siIⅢA序列，設(shè)計(jì)模板DNA鏈，其順序分別為BbsI酶切位點(diǎn)、正義序列、9ntloop連接序列、反義序列、RNA聚合酶III終止子(6個(gè)T)、BamHI酶切位點(diǎn)。c．質(zhì)粒pGPU6／GFP／NeoGnT-V的構(gòu)建及鑒定：先將各組2條模板單鏈退火處理，
7、再與雙酶切后的pGPU6／GFP／Neo質(zhì)粒連接，構(gòu)建成重組體質(zhì)粒。將重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5Q，篩選卡那霉素抗性克隆，利用限制性內(nèi)切酶BbsI和BamHI雙酶切及測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒。大量擴(kuò)增搖菌后，抽提質(zhì)粒純化。2、細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株HepG2在37"(25O／60C02條件下，培養(yǎng)于含10％新生牛血清的RPMI．1640中，每周傳代2---3次。HepG2細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用脂質(zhì)體Lipofectamine2000TM將質(zhì)粒導(dǎo)入HepG2細(xì)胞。用G418篩選陽性細(xì)胞克隆。3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用脂質(zhì)
8、體Lipofectamine2000TM將質(zhì)粒導(dǎo)入HepG2細(xì)胞。用G418篩選陽性細(xì)胞克隆。4、pGPU6／GFP／NeoGnT-VshRNA干擾效果檢測(cè)IIIb．Westernblot檢測(cè)GnT-V蛋白表達(dá)提取總蛋白，用測(cè)定蛋白濃度，吸取50／．tg總蛋白，
