丹參多糖的分離純化與免疫活性的的研究

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1、摘要而且在一定濃度范圍內(nèi)存在劑量依賴性。在上述研究的基礎(chǔ)上，擬將丹參多糖作為一個(gè)免疫增強(qiáng)劑來(lái)開發(fā)，深入研究其精制工藝，完成部分臨床前研究。同時(shí)為了進(jìn)一步開發(fā)利用丹參資源，本課題選取丹參為材料，采用現(xiàn)代分離分析技術(shù)對(duì)丹參多糖組分進(jìn)行了分離、純化，并采用現(xiàn)代功能評(píng)價(jià)方法對(duì)小鼠的免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行了初步研究。實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果1．丹參藥材經(jīng)過(guò)水提醇沉、真空干燥即得水溶性粗多糖(SMPc)。采用苯酚硫酸法測(cè)定丹參總多糖的含量，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。結(jié)果顯示，葡萄糖在0"--'80tag·mLJ范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y

2、=105．26X．1．2998(R2=0．9971)；蛋白濃度在0"--'0．1mg·mL。之間時(shí)，與吸光度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=167．62X．1．4735(R2=0．9991)。結(jié)果表明，本方法精密度高、重現(xiàn)性好，可用于丹參總多糖與蛋白質(zhì)的含量測(cè)定。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)粗丹參多糖中，多糖含量為40．35％、蛋白質(zhì)含量為8．96％。2．采用Sevag法、三氯乙酸法對(duì)丹參多糖進(jìn)行除蛋白處理，通過(guò)比較不同方法處理后的蛋白含量及多糖含量來(lái)確定最佳的除蛋白工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選Sevag法脫蛋白的最佳條件是：料液比為l：l，氯

3、仿與丁醇的配比為4：l，振搖40min，重復(fù)操作次數(shù)為5次，此條件下蛋白質(zhì)去除率為48．65％，多糖保存率為78．6％。三氯乙酸法(4mol·L．1)的最佳濃度為5％(v／v)，此時(shí)其蛋白脫除率為52．30％，多糖保存率為87．57％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三氯乙酸法除蛋白效果優(yōu)于Sevag法。3．采用大孔樹脂法及離子交換層析柱法精制純化粗多糖，綜合比較D．101、AB．8、DB一301及MG．1等4種大孔吸附樹脂對(duì)粗多糖的分離純化效果，進(jìn)一步以DEAE．52離子交換層析法對(duì)過(guò)AB．8柱制備得到的粗多糖進(jìn)行分離精制，經(jīng)4種大孔

4、樹脂初步純化后發(fā)現(xiàn)AB．8、DB-301型的樹脂脫蛋白效果好，脫蛋白效率高，純化后多糖含量分別可達(dá)78．72％、80．45％?？偠嗵墙?jīng)DEAE一52樹脂進(jìn)一步分離純化得到SMPl、SMP2、SMP3三個(gè)組分。結(jié)果表明，AB．8、DB．301n碩士學(xué)位論文型大孔吸附樹脂及DEAE．52型樹脂可應(yīng)用于丹參多糖的精制純化。．4．將60只KM小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型Cy組(75mg·kg。kCy+香菇多糖片(10mg·k岔1)陽(yáng)性組，Cy+丹參多糖高劑量組(300mg·k91)、Cy+丹參多糖中劑量組(200mg·k礦1)

5、+Cy和Cy+丹參多糖低劑量組(100mg·kg-1)共6組，在給藥10天后，進(jìn)行碳粒廓清實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算臟器指數(shù)、吞噬指數(shù)和吞噬系數(shù)，觀察丹參多糖對(duì)CY誘導(dǎo)的免疫低下小鼠相關(guān)免疫臟器及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出：(1)丹參多糖對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響：①與正常組比較，Cy模型組的胸腺系數(shù)、脾臟系數(shù)顯著降低(PO．05)。表

6、明丹參多糖各劑量組均可對(duì)抗Cy引起的脾萎縮，使脾臟系數(shù)上調(diào)。③丹參多糖中、高劑量組的胸腺系數(shù)與模型組比較顯著上調(diào)(P0．05)。表明丹參多糖各劑量組均可對(duì)抗Cy引起的胸腺萎縮，使胸腺系數(shù)上調(diào)。(2)丹參多糖對(duì)小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能影響：①與正常組比較，Cy模型組中廓清指數(shù)K及吞噬指數(shù)a均顯著降低(P<0．05)。表明Cy能顯著降低小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，造模成功。②與模型組比較，陽(yáng)性藥組的K、a值均顯著上調(diào)(PO．05)。表

7、明陽(yáng)性藥香菇多糖可使免疫功能抑制小鼠的吞噬功能上調(diào)。③丹參多糖低劑量、中劑量組的K、a值與模型組比較均顯著上調(diào)(P<0．05)，與正常組比較則無(wú)顯著差異(P>0．05)。表明丹參多糖低、中劑量組可使免疫抑制小鼠的吞噬功能上調(diào)。高劑量的吞噬系數(shù)a、吞噬指數(shù)K與模型組比較無(wú)顯著性差異(P>0．05)，作用隨著劑量的增加而有一定的減弱。5．通過(guò)丹參多糖對(duì)免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL一10、IFNq的影響研究，111摘要進(jìn)一步探討丹參多糖對(duì)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。取80只健康NIH小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型Cy組、Cy+阡t

8、性對(duì)照組、Cy+粗多糖(SMPe)小劑量、Cy+粗多糖大劑量組(100、300mg·kg‘1)，Cy+丹參純多糖(SMP)低劑量、Cy+純多糖中劑量、Cy+純多糖高劑量組(100、200、300mg·kg。)，共8組，每組10只。正常對(duì)照組，每天灌胃生理鹽水1次，0．2ml／109，連續(xù)給藥10d。除正常對(duì)照組外其余各組分別于第1