一株破乳菌破乳有效成分分析及其強化培養(yǎng)條件優(yōu)化

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1、國內圖書分類號：X703.5學校代碼：10213國際圖書分類號：628.3密級：公開工學博士學位論文一株破乳菌破乳有效成分分析及其強化培養(yǎng)條件優(yōu)化博士研究生：徐暘導師：馬放教授申請學位：工學博士學科：環(huán)境工程所在單位：市政環(huán)境工程學院答辯日期：2010年3月授予學位單位：哈爾濱工業(yè)大學ClassifiedIndex:X703.5U.D.C:628.3DissertationfortheDoctoralDegreeinEngineeringANALYSISOFEFFECTIVEDE-EMULSIFICATIONCOMPONENTSPR

2、ODUCEDBYASTRAINANDOPTIMIZATIONOFITSINTENSIFIEDCULTURECONDITIONCandidate:XuYangSupervisor:Prof.MaFangAcademicDegreeAppliedfor:DoctorofEngineeringSpeciality:EnvironmentalEngineeringAffiliation:SchoolofMunici.&Envir.Eng.DateofDefence:March,2010Degree-Conferring-Institutio

3、n:HarbinInstituteofTechnology摘要摘要生物破乳劑是多種有效成分共存的復雜體系。目前對破乳有效成分缺乏足夠的認識，難于人工調控活性物質的產量導致破乳能力不穩(wěn)定、效率不高是其無法大規(guī)模生產應用的根本原因。系統(tǒng)分析生物破乳劑成分可使代謝調控、改善其破乳性能成為可能；同時尋找新的手段和方法提高破乳效率也可為生物破乳劑的發(fā)展注入新的活力。以破乳菌的分離、篩選為基礎，摸索破乳菌培養(yǎng)條件，明確環(huán)境因素對其破乳效能的影響；深入研究生物破乳劑的破乳有效成分，優(yōu)化提取、純化手段，分離出破乳活性物質并利用現(xiàn)代化表征技術加以解析

4、；初步探討破乳菌株混合強化培養(yǎng)對破乳性能的提升。結合生物表面活性劑的篩選方法及破乳性能測試，從大慶原油污染土壤中分離出一株高效破乳菌，經16SrDNA鑒定，明確該菌為莫海威芽孢桿菌（Bacillusmojavensis），編號XH-1。通過破乳實驗及生物量的測定，對影響破乳菌生長和菌體發(fā)酵液破乳能力的培養(yǎng)條件進行考察，使用MMSM培養(yǎng)基,得出最適于培養(yǎng)液破乳的發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基初始pH6.5，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉數(shù)140rpm，培養(yǎng)時間24h。該菌株培養(yǎng)液表現(xiàn)出優(yōu)良的破乳性能：室溫下，接觸時間48h，40%投加量可實現(xiàn)O/W模型乳

5、狀液完全破乳；46℃下，接觸時間10h，排油率在80%以上；55℃下，接觸時間10h，排油率為100%。通過對破乳活性成分分布及有效成分耐熱性、耐酸堿性的考察，借助紅外光譜、紫外可見光譜等分析手段確定蛋白類物質為該生物破乳劑的破乳有效成分之一，同時蛋白在溶液中的構象對其破乳能力至關重要。破乳活性物質存在于細胞外，粘連在菌體周圍或游離于發(fā)酵液中，菌體本身不具有破乳能力。采用反復凍融手段及蛋白變性劑處理后，除菌上清液仍保持至少30%破乳活性，證明非蛋白類組分在破乳過程中的作用。提取破乳有效成分，通過對粗提產物破乳能力、產量的比較，選擇最

6、佳粗提方法。結果發(fā)現(xiàn)：XH-1上清液中提取出的多糖、脂類、脂肽類物質基本不具有破乳能力；25%~45%硫酸銨分離及有機溶劑沉淀法均可有效地將破乳活性物質提取出來。使用乙醇沉淀法進行粗提，提取產率高，產物破乳效果好，方法可重復性強。改進提取工藝，粗提產率可達91%，室溫下48h粗提產物排油率接近100%。通過對粗提產物成分及分子量分布分析發(fā)現(xiàn)：粗提物是多種蛋白、多糖等大分子物質和分子量低于1000D的小分子產物共存的復雜體系。-I-哈爾濱工業(yè)大學工學博士學位論文選用HiTrapButyl-SFF疏水相互作用層析，結合Superdex7

7、5凝膠排阻層析的分離方法，純化粗提產物，得到破乳活性物質。純化產物溶液經液相色譜分離得到單峰，通過質譜鑒定確定為具有PEG結構單元的小分子。這些物質分子量分布范圍從200~1000D，在溶液中聚結為膠團，在破乳過程承擔重要作用。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）比較破乳能力不同組分間差異。酶切差異條帶后進行質譜分析，并在數(shù)據(jù)庫中比對，得到四種蛋白，其中一種為疏水蛋白。確認疏水蛋白為破乳有效成分之一，鑒定為Phosphate-bindingprotein。將破乳菌XH-1與枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)在改進

8、的無機鹽液體培養(yǎng)基中強化培養(yǎng)可以有效地提高生物破乳劑的破乳效率。強化培養(yǎng)液在室溫下，接觸時間48h可使O/W型模型乳狀液完全破乳。與單一菌株發(fā)酵全培養(yǎng)液相比，縮短了發(fā)酵時間（提高6h以上），降低了破乳劑投加量，提升了破乳能力和穩(wěn)定性。