多環(huán)芳烴降解菌的降解特性與降解途徑研究

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1、摘要多環(huán)芳烴(PAHs)是一類廣泛分布于海洋環(huán)境中的典型的持久性有機(jī)污染物(POPs)，通過(guò)食物鏈的傳遞會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成極大危害。了解PAHs在環(huán)境中的來(lái)源、分布、歸宿及去除問(wèn)題，已成為當(dāng)今環(huán)境科學(xué)研究的前沿課題。生物降解是環(huán)境(土壤，沉積物，水體)中PAHs去除的最主要途徑。研究其遺傳控制方式，探索代謝途徑，是為了更好地將降解菌應(yīng)用于有效而可控的生物修復(fù)之中。本論文將采集自廈門博坦油碼頭的海水樣品，在持續(xù)性的高濃度、高分子量PAHs選擇壓力下進(jìn)行富集馴化，獲得高分子量PAHs的降解混合菌系，并以此討論高分子量多環(huán)芳烴

2、(HMW．PAHs)降解菌的篩選策略；同時(shí)對(duì)篩選獲得的2株能高效降解PAHs的細(xì)菌從生理生化角度、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)方面進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究，探討其降解特性，解析相關(guān)功能基因及功能酶，并在這些基礎(chǔ)上推測(cè)其代謝途徑。獲得的主要結(jié)果如下：1．用高濃度(1000m班)，混合n鈕s(菲，芘，熒葸，苯并(a)芘)作為選擇壓力，從采自石油污染地區(qū)樣品中馴化獲得混合降解菌系，從中分離得到3株可培養(yǎng)單菌，變性梯度凝膠電泳(PCR—DGGE)跟蹤分析馴化過(guò)程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化及優(yōu)勢(shì)菌形成過(guò)程。采用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定混合菌系BL和3株單

3、菌BLOl，BL02，BL03對(duì)高分子量、難降解的PAH_苯并(a)芘的降解能力，結(jié)合DGGE結(jié)果分析菌系中各單菌在降解過(guò)程中的作用。結(jié)果顯示BL02，BL03不具有降解BaP的能力，BL0l14d后降解了20．98％，三菌混合培養(yǎng)物降解了22．61％；而混合菌系BL14天后降解了44．07％的BaP，這在同類報(bào)道中處于較高水平，顯示了BL對(duì)BaP有較好的降解能力。該篩選策略有助于關(guān)注那些未可培養(yǎng)細(xì)菌在HMW．PAHs降解中的作用，因此采用高濃度、高分子量PAHs的選擇壓力篩選HMw．PAHs的降解菌是一種快速而行之有效的篩選策

4、略。2．對(duì)采自廈門海域的水樣和沉積物樣品，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的PAHs富集培養(yǎng)之后，采用改良的平板升華法成功地篩選到兩株菲高效降解菌，降解能力測(cè)定顯示，它們都能以菲和熒葸作為唯一碳源生長(zhǎng)，72h后均能完全降解起始濃度為lOO摘要mg／L的菲。16SrDNA鑒定結(jié)果顯示這兩株分別為鞘氨醇單胞菌印觸妒mD，姍sp．B2．7和分支桿菌必陽(yáng)D6口c胞，．f“所Sp．S8。3．通過(guò)降解菌對(duì)芳香烴化合物和PAHs降解過(guò)程中常見(jiàn)中間產(chǎn)物的利用情況，菌株B2．7能利用水楊酸，2一萘酚，鄰苯二酚，初步推測(cè)它以水楊酸途徑代謝菲，菌株S8不能降解萘，能利用

5、原兒茶酸，但是不能利用鄰苯二甲酸，很可能是以鄰苯二甲酸以外的途徑代謝菲。降解菌降解熒葸的優(yōu)化條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，非離子表面活性劑T、Ⅳeen-80和營(yíng)養(yǎng)物葡萄糖能促進(jìn)菌株B2．7和S8對(duì)熒蒽的降解。4．芳環(huán)羥基化雙加氧酶和芳環(huán)斷裂雙加氧酶是PAHs降解過(guò)程中開(kāi)環(huán)的兩種關(guān)鍵酶，其中環(huán)羥基化雙加氧酶(RHDs)控制苯環(huán)加氧，是微生物降解反應(yīng)的限速步驟，鄰苯二酚雙加氧酶是催化苯環(huán)開(kāi)裂的重要酶。我們通過(guò)引物設(shè)計(jì)的方法，從降解菌5叻f，挺汐肌D甩甜sp．B2—7中擴(kuò)增得到全長(zhǎng)的鄰苯二酚．2，3·雙加氧酶基因(C230)和環(huán)羥基化雙加氧酶大亞

6、基p矗以)，從分子生物學(xué)角度證明了PAHs降解過(guò)程中的重要酶系鄰苯二酚．2，3．雙加氧酶(C230)和環(huán)羥化雙加氧酶基因0【亞基(p^剃)在菌株B2．7中的存在。對(duì)p辦刪基因構(gòu)建了重組表達(dá)載體，成功在表達(dá)宿主大腸桿菌EcD，fBL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，基因在宿主中以溶解蛋白形式存在?？梢赃M(jìn)一步推斷菌株B2．7降解菲的基本途徑是RHDs氧化PAHs形成二氫二醇PAHs化合物，再在C230的作用下經(jīng)由水楊酸途徑間位裂解(m吡cl鉍vage)苯環(huán)，生成2．羥基粘康酸半醛(2一HMS)。5．采用1．DE(一向凝膠電泳)和2．DE(雙

7、向凝膠電泳)結(jié)合LC．MS／MS(串聯(lián)質(zhì)譜)，研究菌株B2．7在菲誘導(dǎo)與無(wú)菲誘導(dǎo)(對(duì)照)狀況下的蛋白質(zhì)表達(dá)，對(duì)差異蛋白的生物質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行分析，得到多個(gè)代謝途徑中的關(guān)鍵酶(加氧酶、脫氫酶、醛縮酶等)，結(jié)合菌株B2．7的降解特性與降解基因的研究結(jié)果，最終推導(dǎo)出菌株B2．7降解菲較為完整的代謝途徑。關(guān)鍵詞：多環(huán)芳烴，生物降解，苯并[a]芘，鞘氨醇單胞菌，雙加氧酶，代謝途徑2AbstractnlepresenceofpolycyclicaromatichydrocarbonS(PAHs)iIltIleenViror吼entisacons

8、iderablepublichealtllhazardbecauSeoftlleirintrinsicchemicalstabili吼K曲recalcit眥cet0dif!c．erenttypesofdegradationandM曲toxici鑼t0liVing