應(yīng)用胰島新生相關(guān)蛋白（ingap）體外誘導(dǎo)胰島新生

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1、南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文中英文縮寫對照表INGAPIsletneogenesisassociatedprotein胰島新生相關(guān)蛋白ILCsIslet—likecellclusters胰島樣細(xì)胞團(tuán)CKl9cytokera恤19細(xì)胞角蛋白19PDX．1PancreaticduodenalTGF-131EGFbFGFhomeodomain-containingprotein1Transforminggrowthfactor-131Epidermalgrowthfactor胰腺十二指腸同源盒1轉(zhuǎn)化生長因子p1表皮生長因子Basicfibroblastgro

2、wthfactor堿性成纖維細(xì)胞生長因子FBSFetalbovineserumBSABovineserumalbuminDTZDithizoneFITCFluoresceinisothiacyanateELISAGSIS胎牛血清牛血清白蛋白雙硫腙異硫氰酸熒光素Enzyme—linkedimmunoabsorbent酶聯(lián)免疫吸附測定assayGlucosestimulatedinsulinsecretion葡萄糖刺激的胰島素釋放STZStreptozotocin3試驗鏈脲菌素南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本論文座題遮魚塹生擔(dān)差蛋魚(叢魚△里)

3、佳處透昱遮壘塹生是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。論文中除了特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，不包含其他人或機(jī)構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。其他同志對本研究的啟發(fā)和所做的貢獻(xiàn)均在論文中作了明確的聲明并表示了謝意。專業(yè)：內(nèi)匆冷疑心嘛者簽名：叩氯吻參日期：!墨：!蘭!!論文使用授權(quán)聲明本人完全了解南京醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件，允許論文被查閱和借閱；學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容，可以采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存論文。保密的論文在解密后遵守此規(guī)定。作者簽名：堡：墮刷幣簽日期：塑!星：!坌：7

4、南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文應(yīng)用胰島新生相關(guān)蛋白(INGAP)體外誘導(dǎo)胰島新生中文摘要第一部分大鼠胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)和鑒定目的建立成年大鼠胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定的方法。方法V型膠原酶溶液灌注消化成年大鼠胰腺組織，并經(jīng)過Ficoll密度梯度離心去除胰島組織，然后培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMll640培養(yǎng)液，而后加入EGF(表皮生長因子)和bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長因子)繼續(xù)培養(yǎng)，7天可形成單層細(xì)胞，用0．25％胰酶．EDTA消化并傳代培養(yǎng)。取第2代細(xì)胞利用免疫熒光染色和RT-PCR方法檢測CKl9、Pdx．1、Nestin、

5、insulin及glucagon的表達(dá)。結(jié)果經(jīng)膠原酶灌注消化胰腺導(dǎo)管上皮，再經(jīng)過Ficoll密度梯度離心去除胰島組織，可使胰腺導(dǎo)管細(xì)胞得到較好的純化。免疫熒光結(jié)果示胰腺導(dǎo)管細(xì)胞CKl9、Pdx．1和Nestin染色呈陽性，陽性細(xì)胞率分別為(88．6±6．2)％，(84．6±8．6)％，(79．3±10．5)％，而insulin及glucagon染色為陰性。RT-PCR結(jié)果顯示該細(xì)胞表達(dá)CKl9、Pdx一1和Nestin基因。結(jié)論該方法可較好的分離出胰腺導(dǎo)管細(xì)胞，經(jīng)鑒定該法培養(yǎng)所獲細(xì)胞具有胰腺干細(xì)胞的特性。關(guān)鍵詞胰腺；導(dǎo)管細(xì)胞；干細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)4南京

6、醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文第二部分應(yīng)用INGAP體外誘導(dǎo)胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞向胰島D細(xì)胞分化目的建立體外誘導(dǎo)胰腺干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，應(yīng)用胰島新生相關(guān)蛋白(INGAP)建立新的誘導(dǎo)分化體系，實現(xiàn)體外胰島新生。方法體外分離培養(yǎng)SD大鼠胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞，選取第2～6代干細(xì)胞進(jìn)行分步誘導(dǎo)分化，并于分化后期進(jìn)行分組培養(yǎng)，INGAP組加入INGAP多肽，而對照多肽組加入對照多肽，誘導(dǎo)結(jié)束后收獲兩組新生類胰島樣細(xì)胞團(tuán)(ILCs)分別行免疫熒光染色和RT-PCR檢測insulin和glugagon的表達(dá)，并通過葡萄糖刺激的胰島素釋放試驗(GSIS)評價新生ILCs

7、的胰島素分泌能力。結(jié)果第2～6代胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞經(jīng)過體外四步誘導(dǎo)分化，INGAP組和對照多肽組均可形成ILCs，免疫熒光染色結(jié)果顯示ILCsinsulin牙口glucagon染色均為陽性，RT-PCR檢測結(jié)果也證明INGAP組和對照多肽組ILCs均有insulin和glucagon基因的表達(dá)，其中insulin基因的相對表達(dá)量INGAP組為0．324±O．09，對照多肽組為o．102士O．04，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P

8、統(tǒng)計學(xué)意義(P