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《sirna沉默smad3對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖的凋亡影響及其機(jī)制地研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文siRNA沉默Smad3對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其機(jī)制研究研究背景肝纖維化是以肝星狀細(xì)胞（hepaticstellatecell，HSC）的激活和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）在肝內(nèi)過(guò)多產(chǎn)生為主要特征的病理過(guò)程[1,2]，是各種慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段，近年來(lái)隨著對(duì)肝纖維化分子生物學(xué)研究的不斷深入，逐漸認(rèn)識(shí)到肝纖維化是一個(gè)可逆轉(zhuǎn)的過(guò)程[3]。肝星狀細(xì)胞的活化和增殖被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[4]，近年來(lái)研究表明，逆轉(zhuǎn)肝纖維化關(guān)鍵在于減少活化HSC的數(shù)量。肝纖維化是一個(gè)有多種
2、細(xì)胞因子和多條細(xì)胞信號(hào)通路共同參與的復(fù)雜病理過(guò)程。其中TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，TGF-β1被認(rèn)為是肝纖維化的最關(guān)鍵因素[5]。Smads蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白，它存在于人和動(dòng)物多種細(xì)胞中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、胚胎發(fā)育和骨骼重建，并在細(xì)胞外基質(zhì)形成、創(chuàng)傷修復(fù)等生理病理過(guò)程中有重要作用，被視為目前所知最重要的TGF-β受體（TGF-βreceptororTβR）胞內(nèi)激酶底物[6]。目前已發(fā)現(xiàn)的Smads至少有8種，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同可分為三大類：受體調(diào)節(jié)型（R-Smads）；共同通用型（Co-Smad
3、s）；抑制型（I-Smads），其中Smad3與肝纖維化的關(guān)系最為密切[7]。研究表明Smad3能夠促進(jìn)肝纖維化的形成[8]。近年研究發(fā)現(xiàn)Smad3在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，張定鳳[9]認(rèn)為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中Smad3可以刺激HSC增殖，阻斷其傳導(dǎo)可能對(duì)肝纖維化的治療有效；劉波等[10]研究發(fā)現(xiàn)用siRNA沉默Smad3表達(dá)可以抑制人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡；而Tsai等[11]用Smad3腺病毒載體轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)其增殖能力增強(qiáng)。細(xì)胞凋亡是一系列基因激活，表達(dá)及調(diào)控等作用的結(jié)果。目前研究發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)蛋白P5
4、3和Bcl-2與HSC的凋亡有關(guān)，P53是較早發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2是Bcl家族中的重要成員，為凋亡抑制蛋白。RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是新近發(fā)展起來(lái)的一種封閉基因表達(dá)的有效方法。小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)是發(fā)揮作用的重要中間效應(yīng)分子[12]。研究發(fā)現(xiàn)，阻斷Smads信號(hào)傳導(dǎo)通路可能成為一個(gè)治療肝纖維化的新的靶點(diǎn)。導(dǎo)師劉立新[13]的前期研究發(fā)現(xiàn)用siRNA沉默HSC的Smad3基因不僅可以降低HSC表達(dá)纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)
5、和I型膠原蛋白(CollagenproteinI)的水平，而且可以阻止新的肝纖維化致病因子IGFBPrP1誘導(dǎo)的HSC分泌ECM的增多，從而阻止肝纖維化的發(fā)展。為了明確siRNA沉默HSC的Smad3基因是否會(huì)對(duì)HSC的增殖、凋亡以及凋亡相關(guān)蛋白P53和Bcl-2的表達(dá)產(chǎn)生影響，并探討其可能的機(jī)制，設(shè)計(jì)了此實(shí)驗(yàn)。摘要目的觀察Smad3小干擾RNA（siRNA-Smad3）沉默肝星狀細(xì)胞Smad3基因?qū)Ω涡菭罴?xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其可能的機(jī)制。I山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文方法1．選擇大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6）作為研究對(duì)象，分別設(shè)立空白對(duì)照組
6、、陰性對(duì)照組、siRNA-Smad3轉(zhuǎn)染組。siRNA-Smad3轉(zhuǎn)染HSC細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染24h、48h、72h、96h后，應(yīng)用CCK-8檢測(cè)各組HSC增殖的變化。2．選擇大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6）作為研究對(duì)象，分別設(shè)立空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siRNA-Smad3轉(zhuǎn)染組。siRNA-Smad3轉(zhuǎn)染HSC細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后，應(yīng)用Annexin-V/PI雙標(biāo)法流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組HSC的凋亡率。3．選擇大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6）作為研究對(duì)象，分別設(shè)立空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siRNA-Smad3轉(zhuǎn)染組。siRNA-Smad3
7、轉(zhuǎn)染HSC細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞爬片，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)各組HSC凋亡相關(guān)蛋白P53、Bcl-2表達(dá)的變化。結(jié)果1.CCK-8檢測(cè)siRNA-Smad3轉(zhuǎn)染對(duì)HSC增殖的影響：24h、48h、72h轉(zhuǎn)染組HSC增殖（0.27±0.03、0.53±0.03、0.97±0.09）受到顯著抑制，與空白對(duì)照組（0.37±0.02、0.68±0.03、1.13±0.09）和陰性對(duì)照組（0.33±0.06、0.66±0.01、1.17±0.04）相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。24h、48h、72h增殖抑制率分別為19%、20%、18%。96
8、h轉(zhuǎn)染組（1.40±0.08）HSC增殖與空白對(duì)照組（1.45±0.05）和陰性對(duì)照組（1.44±0.03）相比無(wú)明顯變化
