大豆脂肪氧化酶基因rnai表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)調(diào)控的研究

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1、吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文大豆臘肪氧化酶基因RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)調(diào)控的研究摘要本項(xiàng)研究應(yīng)用基因工程手段，克隆大豆脂肪氧化酶基因核心保守序列，構(gòu)建高效的具有hpRNA和mpRNA結(jié)構(gòu)的大豆脂肪氧化酶基因RNAi表達(dá)載體。通過(guò)花粉管通道法將其導(dǎo)入大豆，抑制大豆脂肪氧化酶基因的表達(dá)，調(diào)控脂肪氧化酶的生物合成過(guò)程。以期通過(guò)基因工程手段，改變大豆脂肪氧化酶合成途徑，降低大豆脂肪氧化酶含量，提高大豆油份含量，培育具有優(yōu)良品質(zhì)的大豆品種。取得如下結(jié)果：1．改造植物表達(dá)載體pCAMBIAl301，去除其臂內(nèi)潮酶素基因，并在臂內(nèi)按逆時(shí)針方向添加一個(gè)從

2、質(zhì)粒pBll21上酶切下來(lái)的35S啟動(dòng)子。2．以大豆品種“吉農(nóng)18號(hào)"的基因組DNA為模板，選取大豆三種脂肪氧化酶同功酶基因同源性最高部分，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到大豆脂肪氧化酶基因片段，將其克隆到pMDl8-Tvector載體上．測(cè)序結(jié)果表明：克隆片段大小為357bp。對(duì)比NCBI基因Bank，與已發(fā)表的基因一致。將大豆脂肪氧化酶基因片段按正向+反向的順序插入到pCAMBIAl30135S啟動(dòng)子下，構(gòu)建大豆脂肪氧化酶基因hpRNA干擾表達(dá)載體pCl301LoxRi。通過(guò)花粉管通道法轉(zhuǎn)化大豆品種“吉農(nóng)18號(hào)弦，獲得To代轉(zhuǎn)化籽粒，萌發(fā)后以單棵植

3、株葉片的總DNA為模板，以pCAMBIAl301臂內(nèi)GUS基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果從6棵植株中擴(kuò)增得到720bp的特異帶，回收該條帶連接于pMDl8．Tvector載體并測(cè)序，結(jié)果顯示其為要擴(kuò)增的GUS基因片段。為進(jìn)一步確定外源基因的整合情況，從PCR陽(yáng)性植株中隨機(jī)抽取2株進(jìn)行Southernblot分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化株均有雜交帶出現(xiàn)，外源基因以單拷貝和雙拷貝的形式插入，而未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植株沒有雜交信號(hào)出現(xiàn)，證明外源基因已整合到大豆基因組中。以轉(zhuǎn)基因大豆籽粒的總RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板做RT-PCR，從電泳條帶的亮度上看，

4、轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的內(nèi)標(biāo)18S對(duì)蛆含量相同，而內(nèi)源脂肪氧化酶mRNA的含量明顯降低。3．克隆了大豆“吉農(nóng)18號(hào)一自身的一段內(nèi)含子，片段長(zhǎng)度230bp，將其插入到表達(dá)載體pCl301LoxRi的正義基因片段和反義基因片段中間，構(gòu)建大豆脂肪氧化酶基因mpRNA干擾表達(dá)載體pCl301LoxiRi。通過(guò)花粉管通道法轉(zhuǎn)化大豆品種“吉農(nóng)18號(hào)一，獲得To代轉(zhuǎn)化籽粒，萌發(fā)后以單棵植株葉片的總DNA為模板，以pCAMBIAl301臂內(nèi)T-DNA區(qū)GUS基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果從18棵植株中擴(kuò)增得到720bp的特異帶，回收該條帶連接于p

5、MDl8-Tvector載體并測(cè)序，結(jié)果顯示其為要擴(kuò)增的GUS基因片段。為進(jìn)～步確定外源基因的整合情況，從PCR陽(yáng)性植株中隨機(jī)抽取3株進(jìn)行Southernblot分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化株均有雜交帶出現(xiàn)，外源基因以單拷貝和雙拷貝的形式插入，而未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植株沒有雜交信號(hào)出現(xiàn)，證明外源基因已整合到大豆基因組中。以轉(zhuǎn)基因大豆籽IV吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文大豆脂肪氧化酶基因RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)調(diào)控的研究粒的總RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板做RT-PCR，從電泳條帶的亮度上看，轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的內(nèi)標(biāo)18SRNA含量相同，而內(nèi)源脂肪氧化酶

6、mRNA的含量明顯降低。4．以T1代轉(zhuǎn)化的籽粒為材料，采用紫外分光光度法對(duì)脂肪氧化酶活性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)pCl301LoxRi質(zhì)粒大豆的脂肪氧化酶活性分別為降低62％，轉(zhuǎn)化pCl301LoxiRi質(zhì)粒大豆的脂肪氧化酶活性減低74％。說(shuō)明外源基因的導(dǎo)入有效地抑制了脂肪氧化酶基因的表達(dá)。5．以T1代轉(zhuǎn)化的籽粒為材料，采用SDS．PAGE電泳，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化pCl30ILoxRi質(zhì)粒大豆的脂肪氧化酶含量比對(duì)照平均降低55％，轉(zhuǎn)化pCl30ILoxiRi質(zhì)粒大豆的脂肪氧化酶含量比對(duì)照平均降低71％。6．以Tl代轉(zhuǎn)化的籽粒為材料，轉(zhuǎn)基因植株蛋

7、白質(zhì)的凱氏定氮和索氏提取測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株蛋白質(zhì)含量均有所下降，脂肪含量均有所上升：其中轉(zhuǎn)化pCl301LoxRi質(zhì)粒植株蛋白質(zhì)含量平均為36．06％，比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战档?．95個(gè)百分點(diǎn)(非轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)含量37．01％)，最大降低1．28百分點(diǎn)達(dá)到35．73％，脂肪平均含量23．89％，比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌骄岣吡?．74個(gè)百分點(diǎn)(非轉(zhuǎn)基因脂肪含量23．15％)，最大提高1．09個(gè)百分點(diǎn)，達(dá)到24．24％；轉(zhuǎn)pCl301LoxiRi質(zhì)粒植株蛋白質(zhì)含量平均為35．63％，比非轉(zhuǎn)基因植株對(duì)照降低了1．38個(gè)百分點(diǎn)(非轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)含量37．0

8、1％)，最大降低1．62百分點(diǎn)達(dá)到35．39％，脂肪平均含量24．33％，比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌骄岣吡?．18個(gè)百分點(diǎn)(非轉(zhuǎn)基因脂肪含量23．15％)，最大提高1．61個(gè)百分點(diǎn)，達(dá)到24．76％。