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《楊樹ccr基因rnai表達載體構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、摘要木質(zhì)素是地球上數(shù)量僅次于纖維素的有機物，林木中木質(zhì)素占木材干重的15％～36％，木質(zhì)素生物合成及調(diào)節(jié)在植物生長和發(fā)育中發(fā)揮重要作用，另一方面，木質(zhì)素是制漿造紙業(yè)的不利因素，脫除纖維素中的木質(zhì)素，需要消耗大量能源和使用有毒化學(xué)物質(zhì)，提高了造紙成本并污染環(huán)境。近十幾年來，隨著人們對木質(zhì)素生物合成研究的深入，木質(zhì)素生物合成途徑許多酶的編碼基因被不斷分離克隆出來，調(diào)控木質(zhì)素生物合成途徑中重要酶基因的表達，通過抑制酶的活性，從而阻斷木質(zhì)素生物合成途徑，降低木質(zhì)素的合成量或單體組成，己經(jīng)在煙草和楊樹等植株上取得了成功。因
2、此，利用生物技術(shù)手段降低木質(zhì)素含量或改變其組成，提高楊樹的制漿性能，創(chuàng)造出符合造紙原料要求的林木品種，對于降低制漿造紙的經(jīng)濟成本和保護環(huán)境等都具有重要意義。CCR是木質(zhì)素生物合成途徑的關(guān)鍵酶之一，在木質(zhì)素生物合成途徑中處于終端位置。RNAi(RNAinterference)是一種重要的基因沉默方式，在植物基因功能和遺傳改良研究中廣泛應(yīng)用。為優(yōu)化和建立楊樹遺傳轉(zhuǎn)化體系，探討RNAi技術(shù)在楊樹木質(zhì)素改良中的應(yīng)用效果，建立楊樹RNAi的分子育種新方法，本文以南林95葉片為外植體，對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系進行較系統(tǒng)地研
3、究，構(gòu)建了肉桂酰輔酶A還原酶基因CCR干涉表達載體pBll21+2F，開展了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的楊樹遺傳轉(zhuǎn)化，并對轉(zhuǎn)化植株進行了篩選、PCR檢測和木質(zhì)素含量檢測，獲得了如下主要結(jié)果：1、采用改良的CTAB法提取南林95的基因組DNA，利用PCR技術(shù)克隆得到CCR基因的第4個外顯子部分序列，并將其正向和反向克隆到pUCCRNAi載體上，通過酶切、純化、連接、轉(zhuǎn)化等一系列基因工程操作方法構(gòu)建了含CaMV35S組成型啟動子和卡那霉素篩選基因的RNAi表達載體pBll21+2F，并將其成功的導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中。2、以南林
4、95為試材，對其葉片再生體系進行了優(yōu)化，建立了高效的葉盤法農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，并獲得了經(jīng)抗Kan篩選的RNAi片段的轉(zhuǎn)基因植株。(1)以MS為基本培養(yǎng)基附加不同濃度的6_BA和NA_A，優(yōu)化了南林95的組織培養(yǎng)擴繁體系，外植體培養(yǎng)基(MS+6_BA1．0meJL+NAA0．2mg／L+蔗糖20∥L+瓊脂8e／L)誘導(dǎo)芽增殖，生根培養(yǎng)基為[1／2MS+NAAO．01mg／L+IBA0．2mg／L+蔗糖15g／L+瓊脂8∥L1。(2)用導(dǎo)入pBll21質(zhì)粒的農(nóng)桿菌液轉(zhuǎn)化南林95葉片，通過正交試驗設(shè)計，建立了最佳遺傳轉(zhuǎn)
5、化體系，即外植體預(yù)培養(yǎng)7d，在含AS2001．tmol／L的菌液濃度為0．6的農(nóng)桿菌液中侵染20min，共培養(yǎng)3d，其中適宜的Karl分化篩選濃度為50merlE，生根篩選濃度為30medL。(3)利用篩選出來的最佳遺傳轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化目的片段，獲得了具有RNAi片段的轉(zhuǎn)基因植株。3、對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行PCR檢測，獲得了RNAi片段的轉(zhuǎn)基因植株。對培養(yǎng)3個月的轉(zhuǎn)基因植株進行Klason木質(zhì)素分析，與對照植株相比，木質(zhì)素含量降低20％～30％，且轉(zhuǎn)基因植株的形態(tài)和生長發(fā)育未見異常。結(jié)果表明，利用RNAi技術(shù)抑制CC
6、R基因表達，能有效降低植株的木質(zhì)素含量。綜上所述，通過構(gòu)建CCR基因RNAi表達載體，建立楊樹優(yōu)良無性系葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系，培育出速生、優(yōu)質(zhì)的楊樹新品種，為進一步深入了解木質(zhì)素生物合成提供了研究材料，也為其他樹種的木質(zhì)素基因工程改良奠定理論基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：楊樹，RNAi，CCR，農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化，木質(zhì)素IIAbstractLigninis，secondtocellulose，themostabundantorganiccompoundintheterrestrialbiosphere．Indifferenttree
7、species，lignincontentvariesbetween15and36％ofthedryweightofwood．Ligninisamajorconstituentofcellwallsoffibersandtrachearyelementsandprovidesthesecellsrigidityforstructuralsupportandimpermeabilityforwatertransport．Fortheproductionofhigh_qualitypaper,ligniniscons
8、ideredasanegativefactorbecauseitmustbeextractedfromthecellulosefractionbyenergy-requiringandpollutingmethods．Forthisreason，thereisconsiderableinterestinmodifyingligninbygeneticengineering
