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《楊樹ccr基因rnai表達載體構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化的研究》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、摘要木質(zhì)素是地球上數(shù)量僅次于纖維素的有機物,林木中木質(zhì)素占木材干重的15%~36%,木質(zhì)素生物合成及調(diào)節(jié)在植物生長和發(fā)育中發(fā)揮重要作用,另一方面,木質(zhì)素是制漿造紙業(yè)的不利因素,脫除纖維素中的木質(zhì)素,需要消耗大量能源和使用有毒化學(xué)物質(zhì),提高了造紙成本并污染環(huán)境。近十幾年來,隨著人們對木質(zhì)素生物合成研究的深入,木質(zhì)素生物合成途徑許多酶的編碼基因被不斷分離克隆出來,調(diào)控木質(zhì)素生物合成途徑中重要酶基因的表達,通過抑制酶的活性,從而阻斷木質(zhì)素生物合成途徑,降低木質(zhì)素的合成量或單體組成,己經(jīng)在煙草和楊樹等植株上取得了成功。因
2、此,利用生物技術(shù)手段降低木質(zhì)素含量或改變其組成,提高楊樹的制漿性能,創(chuàng)造出符合造紙原料要求的林木品種,對于降低制漿造紙的經(jīng)濟成本和保護環(huán)境等都具有重要意義。CCR是木質(zhì)素生物合成途徑的關(guān)鍵酶之一,在木質(zhì)素生物合成途徑中處于終端位置。RNAi(RNAinterference)是一種重要的基因沉默方式,在植物基因功能和遺傳改良研究中廣泛應(yīng)用。為優(yōu)化和建立楊樹遺傳轉(zhuǎn)化體系,探討RNAi技術(shù)在楊樹木質(zhì)素改良中的應(yīng)用效果,建立楊樹RNAi的分子育種新方法,本文以南林95葉片為外植體,對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系進行較系統(tǒng)地研
3、究,構(gòu)建了肉桂酰輔酶A還原酶基因CCR干涉表達載體pBll21+2F,開展了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的楊樹遺傳轉(zhuǎn)化,并對轉(zhuǎn)化植株進行了篩選、PCR檢測和木質(zhì)素含量檢測,獲得了如下主要結(jié)果:1、采用改良的CTAB法提取南林95的基因組DNA,利用PCR技術(shù)克隆得到CCR基因的第4個外顯子部分序列,并將其正向和反向克隆到pUCCRNAi載體上,通過酶切、純化、連接、轉(zhuǎn)化等一系列基因工程操作方法構(gòu)建了含CaMV35S組成型啟動子和卡那霉素篩選基因的RNAi表達載體pBll21+2F,并將其成功的導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中。2、以南林
4、95為試材,對其葉片再生體系進行了優(yōu)化,建立了高效的葉盤法農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系,并獲得了經(jīng)抗Kan篩選的RNAi片段的轉(zhuǎn)基因植株。(1)以MS為基本培養(yǎng)基附加不同濃度的6_BA和NA_A,優(yōu)化了南林95的組織培養(yǎng)擴繁體系,外植體培養(yǎng)基(MS+6_BA1.0meJL+NAA0.2mg/L+蔗糖20∥L+瓊脂8e/L)誘導(dǎo)芽增殖,生根培養(yǎng)基為[1/2MS+NAAO.01mg/L+IBA0.2mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂8∥L1。(2)用導(dǎo)入pBll21質(zhì)粒的農(nóng)桿菌液轉(zhuǎn)化南林95葉片,通過正交試驗設(shè)計,建立了最佳遺傳轉(zhuǎn)
5、化體系,即外植體預(yù)培養(yǎng)7d,在含AS2001.tmol/L的菌液濃度為0.6的農(nóng)桿菌液中侵染20min,共培養(yǎng)3d,其中適宜的Karl分化篩選濃度為50merlE,生根篩選濃度為30medL。(3)利用篩選出來的最佳遺傳轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化目的片段,獲得了具有RNAi片段的轉(zhuǎn)基因植株。3、對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行PCR檢測,獲得了RNAi片段的轉(zhuǎn)基因植株。對培養(yǎng)3個月的轉(zhuǎn)基因植株進行Klason木質(zhì)素分析,與對照植株相比,木質(zhì)素含量降低20%~30%,且轉(zhuǎn)基因植株的形態(tài)和生長發(fā)育未見異常。結(jié)果表明,利用RNAi技術(shù)抑制CC
6、R基因表達,能有效降低植株的木質(zhì)素含量。綜上所述,通過構(gòu)建CCR基因RNAi表達載體,建立楊樹優(yōu)良無性系葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系,培育出速生、優(yōu)質(zhì)的楊樹新品種,為進一步深入了解木質(zhì)素生物合成提供了研究材料,也為其他樹種的木質(zhì)素基因工程改良奠定理論基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞:楊樹,RNAi,CCR,農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化,木質(zhì)素IIAbstractLigninis,secondtocellulose,themostabundantorganiccompoundintheterrestrialbiosphere.Indifferenttree
7、species,lignincontentvariesbetween15and36%ofthedryweightofwood.Ligninisamajorconstituentofcellwallsoffibersandtrachearyelementsandprovidesthesecellsrigidityforstructuralsupportandimpermeabilityforwatertransport.Fortheproductionofhigh_qualitypaper,ligniniscons
8、ideredasanegativefactorbecauseitmustbeextractedfromthecellulosefractionbyenergy-requiringandpollutingmethods.Forthisreason,thereisconsiderableinterestinmodifyingligninbygeneticengineering