水稻twh基因rnai載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

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1、水稻TWH基因RNAi載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化摘要：根據(jù)RNAi表達(dá)載體的設(shè)計(jì)原則，以TWH基因?yàn)榘谢?，將長(zhǎng)度253bp目的片段通過(guò)正反兩個(gè)方向插入表達(dá)載體pR1301中，構(gòu)建RNAi表達(dá)載體pR1301-TWHo通過(guò)根癌農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)法將其導(dǎo)入水稻品種武育粳3號(hào)，獲得34株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，為進(jìn)一步深入研究TWH基因功能奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：水稻(OryzasativaL.)；TWH基因；RNAi(RNAinterference)；載體構(gòu)建;遺傳轉(zhuǎn)化中圖分類號(hào)：S511；Q781文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439-8114(2012)24—579

2、1-03RNA干涉(RNAinterference,RNAi)是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(doub1e-strandedRNA,dsRNA)介導(dǎo)的同源mRNA發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型的缺失現(xiàn)象，屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象。RNAi是在研究秀麗新小桿線蟲(chóng)中被首次發(fā)現(xiàn)[1],利用這一技術(shù)可以有效、特異性降解靶標(biāo)基因mRNA,阻止靶標(biāo)基因的表達(dá)，從而研究目標(biāo)基因的功能。目前，水稻中已有許多利用RNAi技術(shù)進(jìn)行基因功能分析或驗(yàn)證的報(bào)道［2—4］。從水稻育種后代材料中發(fā)現(xiàn)一個(gè)水稻穎殼扭曲突變體，該突變體主要表現(xiàn)為穎殼扭曲變

3、形，子粒充實(shí)不飽滿［5］。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，該突變體穎殼扭曲性狀受一對(duì)隱性基因控制，其對(duì)應(yīng)的TWH基因被精細(xì)定位在第二染色體的SSR標(biāo)記RML25和RML35之間，兩個(gè)SSR標(biāo)記間的物理距離為11.9kb,并確定了其候選基因。該研究通過(guò)構(gòu)建水稻TWH基因的RNAi表達(dá)載體，利用根癌農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)法將其導(dǎo)入水稻品種武育粳3號(hào)中，獲得了轉(zhuǎn)基因水稻植株，為TWH基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。1材料與方法1.1試劑1.2載體及菌株1.3植物材料和遺傳轉(zhuǎn)化方法供試水稻材料為武育粳3號(hào)成熟種子誘導(dǎo)初生愈傷組織，作為與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的受體材料。水稻的

4、組織培養(yǎng)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻以及抗性愈傷組織的篩選與植株再生等參照劉巧泉等［6］建立的高效轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行。1.4PCR引物設(shè)計(jì)及目的片段擴(kuò)增1.5目的片段的克隆將目的片段切下，通過(guò)膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物并純化后連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含100mg/L氨節(jié)青霉素的X-Ga1/IPTG的LE固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取白色單菌落于含100mg/L氨節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，通過(guò)菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，獲得重組載體pMD18-T-TWH，將陽(yáng)性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。1?6RN

5、Ai表達(dá)載體的構(gòu)建7轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)2結(jié)果與分析2?1RNAi表達(dá)載體構(gòu)建2.2水稻遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的獲得以武育粳3號(hào)成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體，經(jīng)根癌農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將表達(dá)載體pR1301-TWH導(dǎo)入水稻中。經(jīng)潮霉素抗性篩選，選擇生長(zhǎng)旺盛的抗性愈傷組織進(jìn)行分化再生培養(yǎng)，最終獲得40株TO代轉(zhuǎn)基因植株。以轉(zhuǎn)基因植株葉片總DNA為模板,用潮霉素基因特異引物P7與P8進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖5）,共有34株檢測(cè)到517bp左右的目標(biāo)片段，PCR陽(yáng)性率為85%。3小結(jié)與討論1）雖然RNA干涉在作用機(jī)制等方面還不十分清楚，但

6、作為一種新的技術(shù)方法，已經(jīng)在各個(gè)不同的生物研究中被廣泛應(yīng)用。應(yīng)用RNA干涉技術(shù)迅速地抑制目的基因的表達(dá)，能盡快了解到目的基因的功能。該研究將構(gòu)建的表達(dá)載體pR1301-TWH導(dǎo)入水稻愈傷組織中，獲得了陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，下一步計(jì)劃將轉(zhuǎn)基因苗移栽到海南試驗(yàn)基地，抽穗后進(jìn)行表型鑒定和表達(dá)分析，研究TWH基因的功能。2）載體設(shè)計(jì)是載體構(gòu)建的關(guān)鍵。由于RNAi機(jī)制只對(duì)成熟的mRNA產(chǎn)生作用，因此用于設(shè)計(jì)RNA干涉載體的靶序列應(yīng)處于基因的一個(gè)外顯子內(nèi)。Wesley等[7]的研究表明RNAi片段的長(zhǎng)度在98?853nt之間都是可行的，不會(huì)對(duì)沉默效率產(chǎn)生明顯影響；

7、同時(shí)將間隔區(qū)內(nèi)含子插入反向互補(bǔ)重復(fù)區(qū)可以增強(qiáng)其穩(wěn)定性。因此，在本研究中我們選擇TWH基因一個(gè)外顯子部分的253bp為靶序列構(gòu)建RNAi載體，并在兩個(gè)反向重復(fù)序列間加入一個(gè)Waxy基因的內(nèi)含子作為間隔區(qū)，目的是為了提高轉(zhuǎn)基因后代的沉默效率，有效抑制目的基因的表達(dá)。參考文獻(xiàn)：[1]FIREA,XUQ,MONTGOMERYnetNature,[2：]CHENJ,TANGWH,HONGMM,eta1?OsBP—73,aricegene,encodesanove169)：806-811.DNA—binding■1htproteinwomainandgenr

8、ferenceedRNAigrowth[J].antrBiology,(3)：[3]PRASADK,JAYRAGHAVANU?Doub1