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《柑橘衰退病rnai載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因植株的評價》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在學術論文-天天文庫。
1、西南大學碩士學位論文柑橘衰退病RNAi載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因植株的評價姓名：陽佳位申請學位級別：碩士專業(yè)：果樹學指導教師：鐘廣炎20100601摘要柑橘衰退病RNAi載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因植株的評價果樹學專業(yè)碩士研究生陽佳位指導教師鐘廣炎研究員摘要柑橘產(chǎn)業(yè)是我國南方農(nóng)村的重要支柱產(chǎn)業(yè)，而每年由柑橘衰退病病毒(Citruslristezavirus，CTV)造成的經(jīng)濟損失巨大。柑橘衰退病病毒屬于正義單鏈RNA病毒。由于利用RNAi技術進行抗植物RNA病毒已有大量成功的報道，所以應用RNAi原理進行抗C
2、TV育種可能成為解決CTv防治的有效方法。RNA病毒侵染植物時，一般表達沉默抑制因子使宿主植物細胞中RNAi機制鈍化從而達到成功侵染植物的目的。因此阻斷病毒的沉默抑制因子的表達將有助于植物抵抗病毒的侵染，從而達到抗病毒的效果。本試驗將CTV中三個沉默抑制因子刀5、p20和p23作為RNAd靶標序列，目的是要獲得對柑橘CTV有廣譜抗性的柑橘品種。(1)RNAi載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植株的驗證根據(jù)CTV基因組RNA中的沉默抑制因子刀5、p20初朋3的序列保守區(qū)域設計引物，經(jīng)RT．PCR成功克隆相關基因片段。利
3、用重疊延伸PCR拼接法(GeneSplicingbyOverlapExtension，SOE)拼接PCR產(chǎn)物，獲得兩條多基因大片段P2520、P252023。為了便于克隆操作，在正向片段下游引物末端加上限制性內(nèi)切酶BglII識別序列；在巢式PCR上游引物末端加上KpnI識別序列，下游引物加上BgllI識別序列，經(jīng)TA克隆得到含兩個沉默抑制因子加5和p20基因片段的反向重復序列載體pTZ57R-HP2520。應用同樣的方法得到含三個沉默抑制因子p25，p204rqTp23基因片段的反向重復序列載體pTZ57R
4、-HP252023。載體pTZ57R-HP2520與pCAMBIA．2301G經(jīng)SacI和BamHI雙酶切，膠回收目的片段后用T4．DNA連接酶連接兩個片段，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5Q中，提取質(zhì)粒后用SacI和BamHI雙酶切檢測目的片段。然后將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌LBA4404菌株。含有質(zhì)粒pCAMBIA2301．HP2520的農(nóng)桿菌被用來與錦橙上胚軸共培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因兩南人學碩十學位論文植株。本試驗共獲得了抗性不定芽20個，嫁接后再生成活7株，利用T-DNA區(qū)域內(nèi)的GUS基因特異引物PCR檢測6株為陽性，同時
5、用朋p皿基因特異引物PCR檢測7株為陽性。應用同樣的方法獲得RNAi雙元質(zhì)粒表達載體pCAMBIA2301．HP252023，農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化錦橙上胚軸后誘導獲得抗性不定芽1個，嫁接再生成活1株，經(jīng)特異引物檢測發(fā)現(xiàn)GUS基因和ⅣP孤基因均為陽性。(2)pCAMBIA2301．HP20轉(zhuǎn)基因酸橙植株的評價分兩步對本實驗室已經(jīng)構(gòu)建好的針對沉默抑制因子刀D的單基因片段RNAi(pCAMBIA2301．HP20)轉(zhuǎn)基因酸橙植株進行評價。首先，8株轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過GUS組織化學染色鑒定和針對p20基因的特異引物PCR檢測
6、，證實所有的轉(zhuǎn)基因植株都成功的轉(zhuǎn)入了目的片段。其次，將轉(zhuǎn)基因植株嫁接備份后做攻毒試驗，即對其中5株轉(zhuǎn)基因植株嫁接接種CTV強毒系TRL514。分別在接毒30d、50d和60d后用RT．PCR檢測CTV存在情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照植株和其中兩個轉(zhuǎn)基因植株中的檢查結(jié)果呈陽性，其余三株轉(zhuǎn)基因植株迄今為止沒有檢測出CTV病毒RNA。不過，這三株未檢測到CTV的轉(zhuǎn)基因植株還需要再次進行攻毒試驗，因此，它們是否真正對CTv具有持續(xù)穩(wěn)定的抗性還需要進一步的研究。關鍵詞：柑橘CTV病毒RNA干擾反向重復eDNARNA沉默抑制子抗
7、病毒育種11AbstractConstructionofRNAivectorsofCitrustristezaVirus，genetictransformationandevaluationoftransgenicplantMasterCandidate：YangJiaWeiSupervisor：Prof．ZhongGuangYanCitrusindustryisanimportantpillarindustryinSouthChinaareas．However，theindustryhasbeenthre
8、atenedbyCitrustristezavirus(CTV)，apositive—sensesingle—strandedRNAvirus．SincemanyexamplesofusingRN赴tocontrolplantRNAviruseshavebeenreported．itispossibletoRN～tocontrolCTVincitrus．WhenplantRNAvirusesinfectplant
