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《抗ToCV RNAi載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化番茄的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、分類號(hào)密級(jí)UDC單位代碼10435碩士學(xué)位論文抗ToCVRNAi載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化番茄的研究ConstructionofTomatochlorosisvirusResistantRNAiVectorandGeneticTransformationintoTomato研究生姓名王仁漢指導(dǎo)教師王富教授學(xué)科專業(yè)蔬菜學(xué)研究方向蔬菜遺傳育種及生物技術(shù)中國(guó)·青島二0一八年六月ConstructionofTomatochlorosisvirusResistantRNAiVectorandGeneticTransformationintoTomatoThesissubmit
2、tedtoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomyWangRenhan（CollegeofHorticulture）Supervisor:WangFuQingdao.ChinaJune,2018獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也不包含為獲得青島農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使
3、用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。研究生簽名：時(shí)間：年月日關(guān)于論文使用授權(quán)的說(shuō)明本人完全了解青島農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意青島農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。(保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)研究生簽名：時(shí)間：年月日導(dǎo)師簽名：時(shí)間：年月日青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要抗ToCVRNAi載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化番茄的研究摘要番茄是一種非常重
4、要的經(jīng)濟(jì)作物，其生產(chǎn)狀況直接影響著蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展。番茄褪綠病毒是危害番茄的主要病毒之一，該病嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)，使番茄產(chǎn)業(yè)遭受巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于傳統(tǒng)的病毒防治方法效率較低，不能從根本上解決番茄褪綠病毒，因此，使用分子生物學(xué)技術(shù)培育抗病品種成為控制番茄褪綠病毒病的最有效途徑。基因工程中RNAi技術(shù)的快速發(fā)展，為番茄褪綠病毒病的防治提供了一個(gè)新策略。本研究借助RNAi技術(shù)，首先選擇ToCVHsp70h基因片段作為RNA干涉區(qū)，構(gòu)建含有Hsp70h基因反向重復(fù)序列的干擾載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，獲得抗ToCV的Micro-Tom轉(zhuǎn)基因植株，并對(duì)其抗番茄褪綠
5、病毒能力進(jìn)行研究。主要結(jié)果如下：1.成功構(gòu)建了抗ToCVRNAi植物表達(dá)載體。Hsp70h蛋白參與病毒復(fù)制的特殊過(guò)程。選擇ToCVHsp70h基因的178bp基因片段作為干涉區(qū)，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異引物Hsp70h正向L/R和Hsp70h反向L/R。在引物5'加入不同的酶切位點(diǎn)，控制正、反目的基因連接載體的方向。將PCR擴(kuò)增得到的反向目的片段和正向目的片段先后插入到RNAi植物表達(dá)載體pFGC5941，構(gòu)建含有ToCVHsp70h基因反向重復(fù)序列的RNAi植物表達(dá)載體pFGC5941-H2。通過(guò)PCR、酶切、測(cè)序驗(yàn)證，均證明抗ToCV的RNAi植物表達(dá)載
6、體pFGC5941-H2構(gòu)建成功，可用于進(jìn)一步研究。2.通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)番茄遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植株轉(zhuǎn)化法，將RNAi植物表達(dá)載體pFGC5941-H2整合到農(nóng)桿菌菌株EHA105中，對(duì)番茄Micro-Tom葉盤進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。經(jīng)抗生素篩選和脫菌培養(yǎng)獲得了抗性芽，進(jìn)一步進(jìn)行生根培養(yǎng)后獲得了完整的草銨膦抗性植株。經(jīng)過(guò)抗性篩選獲得22株陽(yáng)性苗。對(duì)陽(yáng)性植株進(jìn)行PCR分子鑒定，檢測(cè)到其中有4株（A、B、C、D）表現(xiàn)陽(yáng)性。結(jié)果表明目的基因已經(jīng)整合到番茄Micro-Tom中，獲得4株轉(zhuǎn)基因番茄。3.轉(zhuǎn)基因植株攻毒試驗(yàn)，表明ToCVHsp70h基
7、因表達(dá)被抑制，轉(zhuǎn)基因番茄植株抗ToCV能力增強(qiáng)。對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄植株的接種番茄褪綠病毒，沉默Hsp70h基因的番茄植株褪綠癥狀明顯輕于對(duì)照植株。在mRNA水平上檢測(cè)該病毒，ToCVCP的表達(dá)量在4株轉(zhuǎn)基因番茄表現(xiàn)出一定差異，C的表達(dá)量最低，其次是D、A、B，基因沉默I青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要植株毒量低于較對(duì)照組，表明Hsp70h基因表達(dá)被抑制，RNA干擾ToCVHsp70h基因?yàn)榭狗淹示G病毒的研究提供了技術(shù)支持。關(guān)鍵詞:番茄；番茄褪綠病毒；干擾載體；轉(zhuǎn)化；基因表達(dá)II青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文AbstractConstructionofTomatochl
8、orosisvirusResistantRNAiVectorandGenetic
