菊花rnai載體構(gòu)建與青蒿遺傳再生體系的建立

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1、＇單位代碼１０４７５＇？學(xué)號(hào)１０４７５３１２０９７０分類號(hào)７Ｑ３呼為乂聲碩：ｔ學(xué)位論文＇菊花ＲＮＡｉ載休構(gòu)建與青富遺傳再生體系的建立學(xué)科、專業(yè)：遺傳學(xué)研究方向：植物表觀遺傳學(xué)申請(qǐng)學(xué)位類別：理學(xué)碩±申請(qǐng)人：馬煥新指導(dǎo)教師？；王子成教授二〇—五年五月CONSTRUCTIONOFRNAiEXPRESSIONVECTOROFDENDRANTHEMA×MORIFOLIUMMET1GENEANDESTABLISHMENTOFREGENERATIONSYSTEMOFARTEMISIAANN

2、UAL.ADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByMaHuanxinSupervisor:Prof.WangZichengMay,2015摘要菊花（Dendranthema×morifolium）是多年生宿根草本植物，因其品種、花色和花型眾多，具有很高的觀賞價(jià)值，而備受大眾喜愛(ài)和研究者的青睞。青蒿（ArtemisiaannuaL.）是一年生草本植物，常作為菊

3、花嫁接的優(yōu)良砧木。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的一種重要的修飾方式，在植物中普遍存在且發(fā)揮著重要的作用。RNAi(RNAiinterference)是關(guān)閉特定基因的新技術(shù)，在植物功能基因組、植物育種、植物抗逆方面得到廣泛應(yīng)用。本研究以DNA甲基化修飾能影響植物的形態(tài)特征以及RNAi信號(hào)能夠通過(guò)砧木傳遞作為研究基礎(chǔ)。構(gòu)建能夠影響菊花但不影響青蒿MET1基因的RNAi載體，同時(shí)建立青蒿的遺傳再生體系，為后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。研究主要結(jié)果如下：（1）靶基因序列克隆以菊花紫精靈為實(shí)驗(yàn)材料，克隆得到含有不同酶切位點(diǎn)、大小為273bp的片段，經(jīng)測(cè)序分析，同源性為97%。確定該

4、序列即為紫精靈MET1基因的一部分。（2）菊花RNAi載體的構(gòu)建將靶基因片段通過(guò)酶切-連接法，正反向插入載體DHpart27RNAiFADP1P4上，經(jīng)特異性引物PCR擴(kuò)增驗(yàn)證、酶切和測(cè)序，證實(shí)菊花MET1基因序列在載體構(gòu)建中未發(fā)生突變，RNAi載體構(gòu)建成功。通過(guò)凍融法成功將RNAi載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。（3）本研究取自種青蒿生長(zhǎng)40天的幼嫩的葉片、葉柄為外植體，建立了葉片和葉柄的遺傳再生體系。①葉片和葉柄最佳的消毒效果分別是：0.1%的升汞中浸泡8mim和0.1%的升汞中浸泡10mim。葉片和葉柄存活率分別達(dá)到92.1%和84.5%。②最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基

5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葉片和葉柄均在培養(yǎng)基配方為：MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉的固體培養(yǎng)基上愈傷誘導(dǎo)最好，并且葉柄誘導(dǎo)率達(dá)到95.7%,遠(yuǎn)高于葉片的誘導(dǎo)率（78%）。③最佳分化培養(yǎng)基葉片在培養(yǎng)基MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉的固體培養(yǎng)基上分化率最高達(dá)到95.3%。葉柄在培養(yǎng)基MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D+3%蔗I糖+0.7%瓊脂粉的固體培養(yǎng)基上能一次成苗，成苗率為11%。④最優(yōu)生根培養(yǎng)基將分化出的青蒿幼苗在1/2MS+1.0mg/LNAA+3%蔗糖

6、+0.7%瓊脂粉的培養(yǎng)基上生根，在轉(zhuǎn)接后的第6天，有白色的根眼萌發(fā)，根生長(zhǎng)快并且粗壯，生根率達(dá)到98.9%。21天后將生好根的青蒿，移栽到室外，成活率為90%。關(guān)鍵詞：菊花，RNAi載體，青蒿，遺傳再生體系IIABSTACTChrysanthemum(Dendranthema×morifolium)isaperennialherbaceousplantwithperennialroot,whichispopularforitsexceptionallydiverseinvarieties,flowershapeandcolor.SweetWormwoodHerb(

7、ArtemisiaannuaL.)isannualherbsandregardedastherootstockusedinthechrysanthemumgrafting.Asthemostcommonepigeneticmodification,DNAmethylationplaysanimportantroleinplant.Asanewtechnologyforknockingoutspecificgenes,RNAi(RNAiinterference)isappliedextensivelytoplantfunctionalgenomics,plantst

8、ressr