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《草莓pldα+cdna克隆及其反義基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文草莓PLDαcDNA克隆及其反義基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究姓名：盧秀麗申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：羅淑萍;袁海英20090601草莓皿D儀eDNA克隆及其反義基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究摘要草莓(Fragariat2tlal'tO$SQDueh．)是～種多年生草本植物，在世界許多國家都有分布。它的果實是典型的非躍變型果實，采收后極易腐爛變質(zhì)，不耐貯藏，在這一過程中細胞壁及細胞膜結(jié)構(gòu)的降解代謝起了促進作用。因此，在果實成熟衰老過程中保持細胞膜結(jié)構(gòu)和細胞區(qū)域化結(jié)構(gòu)的完整性具有重要作用。磷脂酶Da(PLDa)與草莓果實的成熟有關(guān)，其活性的增加是細胞膜衰老時受損的第一
2、步，因而有效控制PLDa的活性有助于研究PLDa基因?qū)Σ葺麑嵞唾A性的影響。本研究采用PlantRNAReagentKit從達賽萊克特(Darseleet)草莓完熟果實中提取出純度較高、完整較好的總RNA，利用RT-PCR技術(shù)擴增得到PLDa基因的HKD2功能區(qū)基因序列，將其T-A克隆至pMDl9．Tsimpleveetor上，測序正確后克隆載體經(jīng)雙酶切消化，目的片斷反向插入到植物表達載體pBll21中，構(gòu)建草莓PLDa基因的反義植物表達載體pBll21．PLD。通過凍融法將攜帶反義eDNA的植物表達載體質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA44404，并對草莓進行遺傳轉(zhuǎn)化研究，以期獲得該基因表達的缺陷型
3、植株，進而確定其在草莓果實成熟衰老中的調(diào)控作用。在實驗過程中同時構(gòu)建草莓PLDa基因正義植物表達載體pBll21．PLD，并對其進行了遺傳轉(zhuǎn)化，目的是在后續(xù)的果實耐貯實驗中對兩者進行比較。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系中，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的農(nóng)桿菌，用無激素的液體MS培養(yǎng)基稀釋成OD6∞值為0．3"-0．6的侵染液，侵染已預(yù)培養(yǎng)3d的草莓葉盤10min，共培養(yǎng)3d，用液體MS培養(yǎng)基沖洗葉片，濾紙吸干后轉(zhuǎn)到含Cef300mg·LJ分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～10d，再轉(zhuǎn)到Cef300mg·L～、Krn20rag·L‘1的選擇培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)。經(jīng)Km選擇壓初步篩選出6棵轉(zhuǎn)基因草莓植株。對獲得的抗性植株進行P
4、CR擴增和Southernblotting雜交分析，有4株為陽性，說明目的基因已整合到草莓基因組中。關(guān)鍵詞：草莓；PLDa基因；反義植物表達載體；遺傳轉(zhuǎn)化；Southem雜交CloningofPLDaeDNAinStrawberryandStudiesofAntisenseGeneGeneticTransformationAbstractStrawberry(FragariaaTqa，：lassaDuch)isakindofperennialherb，whichwascultivatedwidelyintheworld．Strawberryfruitisatypicalnon-elimate
5、ricfruitandgetrotteneasilyafterpicked，whichwasacceleratedbythecatabolicbreakdownofcellularstructuresuchasthecellwallandthecytomembrane．Thereforekeepingintegrityofmembranestructureandcompartmentalizationplaysallimportantroleintheprocessofripening．PLDaisrelatedtomaturityofstrawberryfruitandincreasing
6、activityofPLDaisthefirststeptodamagemembraneincellsenescence．EffectivelycontrolledtheactivityofPLDawillconducedtostudytheeffectofPLDageneonstorageperiod．TotalRNAwasextractedfromthematurefruitofDarselectstrawberrybyPlantRNAReagentKit,thenHKD2domaingeneorderwasamplifiedbyreversetranscdptasepolymerase
7、chainreaction(R二PCR)andclonedintopMDl9一Tsimplevector．Thepositiveclonesweresenttosequence．AfterconfirmingitsvaliditycloningvectorWasdigestedwithdoubledigestion,thePLDagenefragmentwasinvertedinverselyintoplan
