資源描述：
《has-microrna-212在肝癌中抑制組蛋白去甲基化酶rbp2表達(dá)參與肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、山東大學(xué)碩士學(xué)位論文has--microRNA--212在肝癌中抑制組蛋白去甲基化酶RBP2表達(dá)參與肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究姓名：梁修明申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：病原生物學(xué)指導(dǎo)教師：賈繼輝20120420山東大學(xué)碩士學(xué)位論文hsa．microRNA-212在肝癌中抑制組蛋白去甲基化酶RBF2表達(dá)參與肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究碩=l=研究生：導(dǎo)師：中文摘要梁修明賈繼輝教授目的：研究一種組蛋白去甲基化酶的microRNA調(diào)控機(jī)制，從而豐富我們對(duì)于microRNA分子參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為microRNA作為一種潛在的腫瘤治療靶位提供一定的參考。方法：1．在
2、組織水平上，我們用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)T20對(duì)(肝癌組織和肝正常組織)標(biāo)本中hsa--microRNA．．212的水平，和先前我們檢測(cè)的RBP2在這些組織中的表達(dá)水平進(jìn)行對(duì)比分析，初步確定兩者之間的相關(guān)性。我們還在這些組織中檢測(cè)了已知的RBP2下游的靶分子p27kipl矛flpl6‘”k48mRNA的表達(dá)水平，進(jìn)一步分析hsa．．microRNA．212，RBP2，p27。ipl平Llpl6‘nk48這幾個(gè)分子之間的相關(guān)性。2．在分子水平上，我們應(yīng)用hsa-．microRNA．．212的高表達(dá)質(zhì)粒和抑制質(zhì)粒處理肝癌細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)RBP2在mRNA和蛋白水
3、平表達(dá)的影響，以及這些處理對(duì)RBP2下游的靶分子細(xì)胞周期伺己賴(lài)性激酶抑制劑(CDKI)p27邯1幣npl6'ink48的表達(dá)水平的影響。我們同時(shí)也檢測(cè)Thsa．．microRNA．．212的高表達(dá)質(zhì)粒和抑制質(zhì)粒處理后，肝癌細(xì)胞的衰老表現(xiàn)和增殖狀況，進(jìn)一步確定hsaImicroRNA．212通過(guò)調(diào)控RBP2所引起的生物學(xué)效應(yīng)。最后我們通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因分析的方法，檢測(cè)了hsa．．microRNA．．212對(duì)于RBP2分子mRNA的3’．UTR的作用。具體方法如下：(1)．利用羅氏轉(zhuǎn)染試劑把hsa．．micmRNA-．212的高表達(dá)質(zhì)粒和抑制質(zhì)粒以及各自的對(duì)
4、照質(zhì)粒轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞系HepG．2和SMMC．7721中，48d,時(shí)后收細(xì)胞，用Tfizol提取總RNA，再用ABI公司microRNA反轉(zhuǎn)錄專(zhuān)用試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA后山東大學(xué)頤上學(xué)位論文用該公司的專(zhuān)用熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)用實(shí)時(shí)定量PcR檢測(cè)RBP2及其調(diào)控的p27kipl矛1]p16in“8mRNA的表達(dá)水平。RBP2蛋白水平的變化用WesternBlot方法分析。(2)．hsa-microRNA．212的高表達(dá)質(zhì)粒及其對(duì)照質(zhì)粒被轉(zhuǎn)入肝癌HepG．2和SMMC．7721細(xì)胞中48d'時(shí)后，經(jīng)3％甲醛固定細(xì)胞后，進(jìn)行衰老相關(guān)的D一半乳糖
5、苷酶染色(SA—D-Galstaining)，檢測(cè)細(xì)胞衰老情況。(3)．hsa—microRNA．212的高表達(dá)質(zhì)粒及其對(duì)照質(zhì)粒被轉(zhuǎn)入肝癌HepG一2和SMMC-7721細(xì)胞中48d,時(shí)后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，從每組取300個(gè)細(xì)胞，放入孵箱培養(yǎng)2周后，進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)，即進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的大小。)(4)．回復(fù)實(shí)驗(yàn)：先NHepG．2細(xì)胞中轉(zhuǎn)入hsa．microRNA．212的高表達(dá)質(zhì)粒及其對(duì)照質(zhì)粒，24d,時(shí)后再向細(xì)胞中轉(zhuǎn)入RBP2高表達(dá)質(zhì)粒及其對(duì)照質(zhì)粒，48d,時(shí)后用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。先向SMMC一7721細(xì)胞中轉(zhuǎn)入hsa—microRN
6、A．212的抑制質(zhì)粒及其對(duì)照質(zhì)粒，24d,時(shí)后再向細(xì)胞中轉(zhuǎn)入RBP2特異性干擾RNA及其陰性對(duì)照序列，48d,時(shí)后用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。(5)．把hsa-microRNA．212的高表達(dá)質(zhì)粒和帶有RBP23'-UTR并[I預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)突變的熒光素酶報(bào)告基因分別共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系，檢NIJhsa．microRNA．212對(duì)于RBP23'-UTR是否為直接的結(jié)合而發(fā)揮調(diào)控作用。3．在整體動(dòng)物水平驗(yàn)證hsa．microRNA．212對(duì)于RBP2的調(diào)節(jié)作用從而達(dá)到干預(yù)腫瘤發(fā)生和生長(zhǎng)的效果。把10只7周齡的裸鼠平均隨機(jī)分成兩組，每組5只。其中一組注射轉(zhuǎn)染hs
7、a．microRNA．212高表達(dá)質(zhì)粒48d,時(shí)后的HepG．2細(xì)胞，注射量為1X106個(gè)細(xì)胞／只。對(duì)照組注射轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒48d,時(shí)后I拘HepG．2細(xì)胞，注射量和前一組相同。觀察每組裸鼠腫瘤的形成和生長(zhǎng)情況。5周后麻醉處死裸鼠后，分離腫瘤組織，一半凍于一80度冰箱以用于RNA水平檢測(cè)hsa．microRNA．212和RBP2的表達(dá)，另一半浸泡于中性福爾馬林以制作石蠟切片，做免疫組化檢鋇URBP2的表達(dá)。結(jié)果：1．組織水平檢測(cè)中，在mRNA水平，RBP2的表達(dá)在肝癌組織中比肝正常組織2山東人學(xué)碩士學(xué)位論文中顯著升高，且hsa．microRNA．212的表達(dá)
8、和正常組織相比，其在肝癌組織中明顯表達(dá)下調(diào)。此外，p27“P1和p
