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《htert啟動(dòng)子介導(dǎo)的e1ail-24共表達(dá)靶向腺病毒載體對(duì)肝癌抑瘤效應(yīng)及其分子機(jī)制研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、博士學(xué)位論文論文題目hTERT啟動(dòng)子介導(dǎo)的E1A/IL-24共表達(dá)靶向腺病毒載體對(duì)肝癌抑瘤效應(yīng)及其分子機(jī)制研究汪小華研究生姓名繆競(jìng)誠(chéng)、楊吉成（教授）指導(dǎo)教師姓名免疫學(xué)專業(yè)名稱腫瘤分子免疫研究方向2012年5月論文提交日期hTERT啟動(dòng)子介導(dǎo)的E1A/IL-24共表達(dá)靶向腺病毒載體對(duì)肝癌抑瘤效應(yīng)及其分子機(jī)制研究中文摘要hTERT啟動(dòng)子介導(dǎo)的E1A/IL-24共表達(dá)靶向腺病毒載體對(duì)肝癌抑瘤效應(yīng)及其分子機(jī)制研究中文摘要目的構(gòu)建hTERT啟動(dòng)子介導(dǎo)的E1A/IL-24共表達(dá)靶向腺病毒載體（pAd-hTERT-E1A-IL-24），研究其對(duì)肝
2、癌的抑瘤效應(yīng)，并從細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)周期、血管形成、浸潤(rùn)等方面，探索其抗腫瘤作用的分子機(jī)制。方法按分子克隆原理，用套式PCR從MCF-7的DNA基因組中亞克隆出hTERT啟動(dòng)子(hTERTp)，將其插入pTrack質(zhì)粒轉(zhuǎn)移載體形成pTrack-hTERT。PCR擴(kuò)增目的片段E1A、polyA-promoter和IL-24基因，依次亞克隆至pTrack-hTERT轉(zhuǎn)移載體，構(gòu)建pTrack-hTERT-E1A-polyA-promoter-IL-24雙基因共表達(dá)靶向轉(zhuǎn)移載體。同理構(gòu)建pTrack-CMV-E1A-polyA-promote
3、r-IL-24雙基因共表達(dá)轉(zhuǎn)移載體。上述二個(gè)構(gòu)建正確的轉(zhuǎn)移載體及pTrack空載體經(jīng)PmeI酶切后與pAdEasy-1腺病毒骨架質(zhì)粒在BJ5183大腸桿菌中同源重組，得到的同源重組質(zhì)粒pAd-hTERT-E1A-IL-24（靶向）、pAd-CMV-E1A-IL-24及pAd經(jīng)PacI酶切、再用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染QBI-293A包裝細(xì)胞，經(jīng)多輪感染和擴(kuò)增后獲得高滴度的Ad-hTERT-E1A-IL-24（簡(jiǎn)稱Ad-h-E1A-IL-24）、Ad-E1A-IL-24及Ad病毒子。將5、10、25、50及100MOI的Ad分別感染SMMC-772
4、1肝癌細(xì)胞，篩選出Ad的最佳感染劑量為25MOI。將最佳感染劑量的Ad-h-E1A-IL-24和Ad-E1A-IL-24病毒子分別感染SMMC-7721肝癌細(xì)胞和HL7702人正常肝細(xì)胞，流式細(xì)胞儀鑒定兩種病毒對(duì)該細(xì)胞的感染率，MTT鑒定其對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用。將體外培養(yǎng)的SMMC-7721肝癌細(xì)胞分成PBS、Ad、Ad-E1A-IL-24及Ad-h-E1A-IL-24組，分別加入最佳感染劑量的上述腺病毒。RT-PCR、間接免疫熒光法和WesternBlot法檢測(cè)外源性E1A和IL-24在SMMC-7721細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)；MTT
5、法檢測(cè)體外抑制肝癌細(xì)胞及人正常肝細(xì)胞HL7702生長(zhǎng)效應(yīng)，Hoechst33258熒光染色及FCM檢測(cè)其誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡效應(yīng)，RT-PCR法檢測(cè)凋亡、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)及腫瘤浸潤(rùn)相關(guān)的細(xì)胞因子Bax、Bcl-2、P21、MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；并建立裸鼠SMMC-7721人肝癌荷瘤模型，觀察體內(nèi)抑瘤作用。將成瘤后的裸鼠分為PBS、Ad、Ad-E1A-IL-24及Ad-h-E1A-IL-24組，每組5只。病毒干預(yù)后測(cè)腫瘤體積及瘤重。免疫組化法檢測(cè)外源性E1A及IL24在荷瘤中的表達(dá)，檢I中文摘要hTERT啟
6、動(dòng)子介導(dǎo)的E1A/IL-24共表達(dá)靶向腺病毒載體對(duì)肝癌抑瘤效應(yīng)及其分子機(jī)制研究測(cè)細(xì)胞凋亡、腫瘤浸潤(rùn)及血管形成相關(guān)因子Bax、Bcl-2、Fas、Caspase3、MMP2、MMP9、VEGF和CD34的表達(dá)。結(jié)果成功構(gòu)建了hTERT啟動(dòng)子和CMV介導(dǎo)的E1A和IL-24共表達(dá)腺病毒載體，并得到表達(dá)高價(jià)Ad-h-E1A-IL-24和Ad-E1A-IL-24的腺病毒載體病毒子。25MOI的最佳感染劑量的Ad-h-E1A-IL24和Ad-E1A-IL24兩組病毒子對(duì)肝癌細(xì)胞的感染率分別65.53%和41.71%（P<0.01）。Ad-h-
7、E1A-IL24病毒子對(duì)HL7702的毒性作用明顯小于Ad-E1A-IL24。RT-PCR檢測(cè)到外源性E1A和IL-24在SMMC-7721細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄，間接免疫熒光法和WesternBlot法均檢測(cè)到外源性E1A和IL-24蛋白在SMMC-7721細(xì)胞中的表達(dá)。體外研究結(jié)果，MTT檢測(cè)結(jié)果表明，Ad-h-E1A-IL-24抑制SMMC-7721肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于Ad-E1A-IL-24組（P<0.05）；FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，與Ad-E1A-IL-24組比較，Ad-h-E1A-IL-24誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡率明顯升高（P<0.05
8、）；RT-PCR結(jié)果顯示，Ad-h-E1A-IL-24能明顯上調(diào)SMMC-7721肝癌細(xì)胞中與細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)的因子Bax和P21的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)也更為顯著。體內(nèi)模型抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ad-h-E1A-IL-24明顯抑制
