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《mtor在tgf-β2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞間葉樣轉(zhuǎn)化過程中的作用》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、南方醫(yī)科大學(xué)2009級(jí)碩士學(xué)位論文mTOR在TGF．p2誘導(dǎo)的入晶狀體上皮細(xì)胞間葉樣轉(zhuǎn)化過程中的作用mTORinTGF—D2inducedEMTinHLECs課題來源：自選課題專業(yè)名稱學(xué)位申請(qǐng)人指導(dǎo)教師答辯委員會(huì)主席答辯委員會(huì)成員眼科學(xué)肖俐佳郭?？平淌谟嗝舯蠼淌陉悅ト亟淌谏诚枸蠼淌陉憰院徒淌趶埩冀淌谡撐脑u(píng)閱人鄭丹瑩教授曾錦教授2012年05月18日廣州碩士學(xué)位論文mTOR在TGF．D2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞間葉樣轉(zhuǎn)化過程中的作用摘要晶狀體上皮細(xì)胞(Lensepithelialcells，LECs)對(duì)晶狀體的生長發(fā)育、維持晶狀體的正常生理功能至關(guān)重要。LECs生長、增殖、移行、分化和分泌細(xì)胞
2、外基質(zhì)的等方面的異常是多種晶狀體疾病特別是后囊膜混濁(postedorcapsularopacification，PCO)的基礎(chǔ)【11。轉(zhuǎn)化生長因子(transforminggrowthfactorp，TGF-p)是上皮細(xì)胞向間葉樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelialtomesenchymaltransition，EMT)的關(guān)鍵因子【2】，現(xiàn)有研究表明，在TGF．p的幾種亞型中，TGF．f12在房水中含量最高，且能有效誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞(HumanlensepithelialcellsHLECs)發(fā)生EMT[31，目前已成為研究PCO時(shí)細(xì)胞模型的常用建造工具【4】。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(ma
3、mmaliantargetofrapamycin，mTOR)是一種非典型的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞生長增殖過程中發(fā)揮中心樞紐的作用圍。此外，mTOR能夠促進(jìn)細(xì)胞的黏附與移行，參與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞向間葉樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化【6】，但是，mTOR是否在LECs中存在表達(dá)，以及mTOR在HLECs向間葉樣轉(zhuǎn)分化過程中的活化水平及其是否參與調(diào)節(jié)HLECs間葉樣轉(zhuǎn)化至今尚未見報(bào)道。目的明確mTOR在TGF．D2誘導(dǎo)的HLECs向間葉樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中的活化情況(磷酸化水平$2448．P，$2481．P)及作用。方法l建3ZTGF．B2誘導(dǎo)HLECs的EMT體外培養(yǎng)體系培養(yǎng)的HLECs．B3細(xì)
4、胞換用無血清DMEM培養(yǎng)基后，加入TGF．p2，使其終濃中文摘要度為10ng／ml，分別培養(yǎng)0h、lh、6h、12h、24h、48h，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，westernblot法檢測(cè)HLECs上皮細(xì)胞標(biāo)志物縫隙連接蛋白43(connexin43，Cx43)、上皮性鈣黏附蛋白(E．cadherin，E—cad)和間葉樣細(xì)胞標(biāo)志物纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、n．平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-smoothmuscleaetin，Q．SMA)的表達(dá)水平。2weStemblot法檢測(cè)mTOR及其磷酸化水平($2448一P，$2481．P)在TGF．f12誘導(dǎo)的HLECs的EM
5、T過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。3觀察mTOR在TGF．f12誘導(dǎo)HLECs的EMT過程中的活化水平及其作用3．1確定mTOR抑制劑雷帕霉素和KU．0063794的最佳作用濃度。將濃度梯度為0riM、10nM、30nM、100nM、300nM、1000nM的mTOR抑制劑雷帕霉素和KU．0063794分別加入HLECs．B3細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，westernblot法檢測(cè)mTOR及其磷酸化水平($2448．P，$2481．P)。根據(jù)二者對(duì)mTOR磷酸化水平的抑制情況以及細(xì)胞的生長狀態(tài)，選擇下一步實(shí)驗(yàn)中雷帕霉素和KU．0063794的作用濃度。3．2觀察mTOR在
6、TGF．艮誘導(dǎo)HLECs的EMT過程中的活化水平以及mTOR抑制劑對(duì)TGF．P12誘導(dǎo)HLECs向間葉樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。3．2．1將實(shí)驗(yàn)分為以下組：對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)的HLECs．B3細(xì)胞系，生長至80％融合后，換用無血清DMEM培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24h。TGF．f12組：常規(guī)培養(yǎng)的HLECs．B3細(xì)胞系，生長至80％融合后，換用無血清DMEM培養(yǎng)基后，終濃度為10ng／mlTGF-D2處理24h。雷帕霉素組：常規(guī)培養(yǎng)的HLECs．B3細(xì)胞系，生長至80％融合后換用無血清DMEM培養(yǎng)基，最佳濃度的雷帕霉素(最佳濃度由上述實(shí)驗(yàn)3得到)處理24h。KU．0063794組：常規(guī)培養(yǎng)的HLECs．B3
7、細(xì)胞系，生長至80％融合后換用無血清DMEM培養(yǎng)基，最佳濃度的KU．0063794(最佳濃度由上述實(shí)驗(yàn)3得到)處理24h。雷帕霉素+TGF．f12組：常規(guī)培養(yǎng)的HLECs．B3細(xì)胞系，生長至80％融合后換用無血清DMEM培養(yǎng)基，最佳濃度的雷帕霉素預(yù)處理lh后，lOng／mJTGF-艮處理Ⅱ碩士學(xué)位論文24h。KU．0063794+TGF．D2組：常規(guī)培養(yǎng)的HLECs．B3細(xì)胞系，生長至80％融合后換用無血清DMEM培養(yǎng)基
