tgf-β2通過pi3kakt信號通路誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化

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1、南方醫(yī)科大學(xué)2010級博士學(xué)位論文TGF．132通過P13K／Akt信號通路誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞上皮．間質(zhì)轉(zhuǎn)化TGF—P2inducesEMTofhumanlensepithelialcellsthroughtheactivationofP131GAktsignalingpathway課題來源：廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目學(xué)位申請人郭瑞導(dǎo)師姓名郭?？茖I(yè)名稱眼科學(xué)培養(yǎng)類型委托培養(yǎng)培養(yǎng)層次博士研究生所在學(xué)院研究生學(xué)院2013年3月8日廣州博士學(xué)位論文TGF．132通過P13K／Akt信號通路誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)

2、化I掣M24IlloLIIM65IIIl3UII攀博士研究生：郭瑞指導(dǎo)教師：郭海科摘要后發(fā)性白內(nèi)障是白內(nèi)障術(shù)后最常見的并發(fā)癥，盡管手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步和人工晶狀體材料及其設(shè)計(jì)的發(fā)展已經(jīng)降低了后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生率，它仍是白內(nèi)障術(shù)后視力下降的主要原因。目前認(rèn)為后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制是手術(shù)殘留的晶體上皮細(xì)胞異常的增殖、纖維化、移行并伴隨細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。上皮細(xì)胞上皮．間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymaltransition，EMT)是指上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特征，是后發(fā)性白內(nèi)障發(fā)生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，通過該轉(zhuǎn)化，晶

3、狀體上皮細(xì)胞間連接消失，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。轉(zhuǎn)化生長因子-9(transforminggrowthfactor-p，TGF-p)是一種多功能蛋白質(zhì)，屬于轉(zhuǎn)化生長因子．D超家族蛋白的成員，具有調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長，分化、凋亡和免疫等多項(xiàng)功能。轉(zhuǎn)化生長因子．p是晶狀體在各種生理和病理狀態(tài)下重要的調(diào)節(jié)因子，能夠干擾正常的晶狀體結(jié)構(gòu)，并能夠誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生異常的增殖、分化和凋亡，與囊膜下型白內(nèi)障以及后發(fā)性白內(nèi)障的形成有著密切的關(guān)系【l‘3J。轉(zhuǎn)化生長因子．D包括三種TGF．p同源異構(gòu)體，轉(zhuǎn)化生長因子．pl，轉(zhuǎn)化生長因子

4、．p2和轉(zhuǎn)化生長因子．p3，其中轉(zhuǎn)化生長因子．p2在眼內(nèi)房水及玻璃體內(nèi)的含量及活性最高，是參與調(diào)節(jié)晶狀體上皮細(xì)胞最強(qiáng)的細(xì)胞因子之一。TGF．p2可以誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生上皮．問質(zhì)轉(zhuǎn)化，使晶狀體上皮細(xì)胞喪失上皮細(xì)胞的極性，獲得較強(qiáng)的遷移、侵襲和抗凋亡的能力等間質(zhì)特性，從而具有類肌纖維母細(xì)胞樣的特征。目前TGF．p2誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞上皮．間質(zhì)轉(zhuǎn)化摘要細(xì)胞模型已成為白內(nèi)障(包括前囊膜下和后囊膜混濁)形成的細(xì)胞模型而被廣泛研究。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種非典型的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇激酶

5、相關(guān)蛋白激酶家族，廣泛的存在于哺乳動物的細(xì)胞漿中。mTOR信號通路與多種細(xì)胞的生長、增殖、分化、遷移、自我更新和細(xì)胞周期等密切相關(guān)，被認(rèn)為是一個調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞生長增殖的信號匯聚點(diǎn)。mTOR可接受生長因子、營養(yǎng)(氨基酸)和能量等多種信號，通過包括P13K／Akt信號通路在內(nèi)的多條信號通路來發(fā)揮作用。目的研究P13K／Akt信號通路在TGF．p2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的作用及其機(jī)制，以期為后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制提供確切的理論依據(jù)，為后發(fā)性白內(nèi)障及此類疾病的藥物干預(yù)提供新的靶點(diǎn)和新的思路及方法

6、。方法1建立TGF—D2誘導(dǎo)HLECs(humanlensepithelialcells)間葉樣轉(zhuǎn)化的體外培養(yǎng)體系常規(guī)培養(yǎng)HLECs．B3細(xì)胞系，待其長至80％融合時(shí)，去除培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，加入不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基。加入TGF．p2，使其終濃度為10ng／ml，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。共聚焦細(xì)胞免疫熒光和westernblotting法檢測HLECs．B3細(xì)胞的上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白——縫隙連接蛋白43(connexin43，Cx43)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白——纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)

7、的表達(dá)變化。2檢測P13列Akt信號通路主要信號分子在TGF．p2誘導(dǎo)HLECs發(fā)生EMT過程中的表達(dá)變化westemblotting法檢測P13眥信號通路主要信號分子，P13K、Akt和mTOR的表達(dá)情況及其磷酸化水平變化。共聚焦細(xì)胞免疫熒光法檢測各組細(xì)胞P．Akt在細(xì)胞內(nèi)的定位。3CCK．8實(shí)驗(yàn)檢測P13K抑制劑LY294002對HLECs細(xì)胞增殖的影響博士學(xué)位論文在96孔板中培養(yǎng)HLEC．B3細(xì)胞，向培養(yǎng)板加入LY294002，使其終濃度分別為O／tM、10“M、20pM、30pM、40肛M、50／aM、6

8、0肛M、70pM和80pM，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24d,時(shí)，向每-TLDI：I入10llLCCK．8溶液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于1h、2h、3h上酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度(A)值，計(jì)算增殖抑制率。4觀察P13K抑制劑LY294002對TGF．p2誘導(dǎo)HLECs細(xì)胞上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化的影響。4．1將細(xì)胞進(jìn)行以下分組：對照組：常規(guī)培養(yǎng)的HLECs．B3細(xì)胞系，生長至80％融合后，換用無血清DMEM培