rnai cycline對肝癌hepg2細(xì)胞生長及細(xì)胞周期的影響

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1、學(xué)校代碼10459學(xué)號或申請?zhí)?007049密級公開椾碩士學(xué)位論文RNAiCyclinE對肝癌HepG2細(xì)胞生長及細(xì)胞周期的影響作者姓名：賈海全導(dǎo)師姓名：趙國強趙明耀專業(yè)學(xué)位名稱：病理學(xué)與病理生理學(xué)培養(yǎng)院系：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院完成時間：2011年9月AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterTheeffectofCyclinERNAionthegrowthandcellcycleofHepatocellularcarcinomacellsHepG2ByHai-QuanJiaSupervisor:Guo-QiangZh

2、ao,Ming-YaoZhaoPathologyandPathophsiologyTheBasicMedicalCollegeofZhengzhouUniversitySeptember10,2011摘要RNAiCyclinE對肝癌HepG2細(xì)胞生長及細(xì)胞周期的影響碩士學(xué)位申請人賈海全推薦導(dǎo)師趙國強趙明耀鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室鄭州市450001摘要背景與目的細(xì)胞周期調(diào)控機制紊亂導(dǎo)致的細(xì)胞生長失控被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的重要機制之一。cydinE是周期蛋白的一種，它能夠與CDK2—起促進細(xì)胞周期的Gl/S轉(zhuǎn)換。研究發(fā)現(xiàn)異常情況下，由于cyclinE無順序無規(guī)律的過度表達(dá)，cyc

3、linE可持續(xù)存在于整個細(xì)胞周期中，不斷激活CDK2和磷酸化pRb，驅(qū)使細(xì)胞超越控制機制發(fā)生異常增殖，引起腫瘤的發(fā)生。此外，cyclinE在細(xì)胞內(nèi)的積累也會導(dǎo)致染色體的不穩(wěn)定性（chromosomeinstability,CIN)，最終引起腫瘤的發(fā)生。研究表明cyclinE的過表達(dá)同中心體的高增殖密切相關(guān)，提示cyclinE持續(xù)的過表達(dá)可引起中心體的異常增殖，擾亂有絲分裂，從而導(dǎo)致早期癌變的發(fā)生。研究表明，cyclinE與肝癌的發(fā)生可能相關(guān)。肝癌（Hepatocellularcarcinoma,HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，我國是肝癌的高發(fā)區(qū)，每年發(fā)病人數(shù)超過全世界肝癌死亡

4、人數(shù)的50%，是中國第2位的腫瘤死亡原因。臨床實驗和動物實驗均表明，肝癌患者癌組織中的cyclinE表達(dá)增加，而且研究也發(fā)現(xiàn)cyclinE的表達(dá)與肝癌的分化程度、侵襲性和臨床分級可能相關(guān)。綜合cyclinE對細(xì)胞周期的調(diào)控特點和cyclinE與肝癌之間的關(guān)系，筆者利用RNA干擾技術(shù)，通過構(gòu)建轉(zhuǎn)染針對cyclinE的siRNA載體，降低肝癌HepG2細(xì)胞中cyclinE的表達(dá)水平，觀測降低肝癌組織中cyclinE的表達(dá)水平對肝癌細(xì)胞生長及細(xì)胞周期的影響。I摘要方法根據(jù)siRNA目標(biāo)序列的選取原則，設(shè)計并合成2對cyclinE基因靶向siRNA序列的DNA單鏈，退火成雙鏈發(fā)卡樣DNA;

5、將其重組入siRNA載體pGFP-V-RS;得到重組子pGFP-V-RS-siCE951和pGFP-V-RS-siCE1122;對重組子的插入序列進行DNA序列測定，并與設(shè)計序列做同源性比較。利用脂質(zhì)體LipofectAmine?2000包裹，將pGFP-V-RS-siCE951、pGFP-V-RS-siCE1122和pGFP-V-Con分別轉(zhuǎn)入人肝癌HepG2細(xì)胞中，同時設(shè)空白對照組（不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒僅加轉(zhuǎn)染試劑）。RT-PCR和Western-Blot方法檢測各組細(xì)胞HepG2mRNA和蛋白表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測各組肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，CCK-8試劑檢測細(xì)胞的增殖，軟瓊脂克隆形

6、成檢測胞克隆形成能力。結(jié)果1.經(jīng)過同源性檢索和優(yōu)選確定951-969位（GCAAAAGGTTTCAGGGTAT)、1122-1140位(GGACAAAGCCCGAGCAAAG)為siRNA靶序列。2.篩選得到重組子pGFP-V-RS-siCE951和pGFP-V-RS-siCE1122，測序分析其插入序列與設(shè)計完全一致。3.干擾1組（轉(zhuǎn)染pGFP-V-RS-siCE951)和干擾2組（轉(zhuǎn)染PGFP-V-RS-siCE1122)細(xì)胞cyclinEmRNA的相對表達(dá)量分別為0.215±0.021和0.178±0.019，顯著低于空白對照組和無關(guān)siRNA對照組（分別為0.406±

7、0.037和0.372±0.042,p<0.05)；在空白對照組與無關(guān)siRNA對照組之間，cyclinEmRNA的相對表達(dá)量無顯著性差異（p>0.05)。4.空白對照組、無關(guān)siRNA對照組、干擾1組和干擾2組細(xì)胞在大約54KD處均有免疫印跡出現(xiàn)，其中空白對照組和無關(guān)siRNA對照組的免疫印跡顯著強于干擾1組和干擾2組。5.細(xì)胞增殖實驗顯示，干擾1組和干擾2組與空白對照組和無關(guān)siRNA對照組比較，在3d、4d、5d細(xì)胞孔內(nèi)的吸光度值顯著減少，差異有顯著性（p<