和厚樸酚對(duì)肝癌hepg2細(xì)胞生長抑制及凋亡的作用

《和厚樸酚對(duì)肝癌hepg2細(xì)胞生長抑制及凋亡的作用》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、和厚樸酚對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞生長抑制及凋亡的作用作者：顧偉,范昕建*,吳疆,張莉敏,李曉芳,牛智強(qiáng)【摘要】　　目的:研究和厚樸酚(honokiol)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響及誘導(dǎo)凋亡作用。方法:用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)不同濃度和厚樸酚對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖活性的效應(yīng),通過顯微鏡、熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;DNA片段化檢測(cè)細(xì)胞凋亡;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和厚樸酚誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的凋亡指數(shù)(AI),caspase3、8、9活性的變化。結(jié)果:和厚樸酚濃度為40～160μmol/L時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖有明顯的抑制效應(yīng),且呈劑量依賴

2、性;細(xì)胞加入和厚樸酚誘導(dǎo)24h后AI明顯高于未加入組(P<0.05),caspase3、8、9活性增高。結(jié)論:和厚樸酚在一定濃度范圍內(nèi)能明顯抑制HepG2細(xì)胞的增殖并能誘導(dǎo)其凋亡,其作用呈濃度依賴性。它可能通過激活caspase途徑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡?！娟P(guān)鍵詞】和厚樸酚HepG2細(xì)胞增殖生長抑制凋亡　　傳統(tǒng)中藥厚樸被廣泛使用于治療許多疾病,和厚樸酚(honokiol)是木蘭科植物厚樸(Magnoliaofficinalis)的有效成分,是一種從中藥厚樸中分離出來的具有生物活性的化合物,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和厚樸酚具有抗氧化、抗血栓形成

3、、抗菌、12和抗腫瘤［1-4］的作用。本研究觀察了和厚樸酚對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響及其誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用?！　?材料和方法　　1.1材料流式細(xì)胞儀(EPICSELITEESP,BeckmanCoulter),二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(SANYO),倒置生物顯微鏡(Olympus),凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc1000,BIORAD),24、96孔培養(yǎng)板(CorningIncorporated),DMEM培養(yǎng)基(Gibco,GrandIsland,NY,USA),小牛血清購于蘭州民海生物有限公司。Hoechest33258、A

4、nnexinVFIFC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購于凱基生物科技發(fā)展有限公司。瓊脂糖,溴化乙錠(EB),甲基噻唑藍(lán)(MTT),二甲基亞砜(DMSO)購于Sigma(St.Louis,MO,USA)和厚樸酚(honokiol)標(biāo)準(zhǔn)品購于中國藥品生物制品檢定所,用二甲基亞砜溶解(DMSO)(終濃度<0.01%)。人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株HepG2,來自ATCC,四川大學(xué)教育部移植免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞室保種。細(xì)胞接種在含100mL/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,在37℃、50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。　　1.2方法　　1.2.1MTT法檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長

5、期人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株HepG2,加入2.5g/L胰蛋白酶消化,吹打制成單個(gè)細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為512×103/L,以每孔體積200μL接種于96孔培養(yǎng)板上。培養(yǎng)24h,待細(xì)胞貼壁后,各孔分別加入不同濃度的和厚樸酚,每孔體積均為200μL,使和厚樸酚終濃度分別為0(對(duì)照組)、20、40、80、160μmol/L(用藥組),每個(gè)濃度作3個(gè)復(fù)孔,同時(shí)點(diǎn)3塊板。分別培養(yǎng)24、48、72h后,加入MTT20μL/孔,置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,每孔加入DMSO150μL,充分振蕩,使藍(lán)紫色沉淀充分溶解。在3

6、0min內(nèi)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定570nm波長處的光吸收值A(chǔ)570。不同時(shí)間點(diǎn)不同濃度和厚樸酚對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制率=(對(duì)照組A570－用藥組A570)/對(duì)照組A570×100%?！　?.2.2形態(tài)學(xué)的觀察每瓶1×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于50mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)24h后加入濃度為0和40μmol/L的和厚樸酚,于24h用倒置顯微鏡觀察?！　?.2.3熒光染色每瓶1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔培養(yǎng)板中,24h后加入濃度為0和40μmol/L的和厚樸酚,培養(yǎng)24h,細(xì)胞在24孔培養(yǎng)板內(nèi)原位固定染色。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗1次,用40

7、g/L多聚甲醛500μL室溫固定15min,用PBS洗2次,棄廢液,加入終濃度為10mg/L,Hoechst33258溶液500μL/孔,37℃染色10min,熒光顯微鏡下觀察。　　1.2.4DNA片段化電泳收集1×106以上的細(xì)胞,12用PBS洗2次,加入100μL細(xì)胞裂解液(10mmol/LTrisHClpH7.4,10mmol/LEDTApH8.0,5mL/LTritonX100)4℃裂解10min,25000g離心20min,收集上清液。加入40ng/LRNase,37℃孵育1h后加入40ng/L蛋白酶K,37℃孵育1h,加

8、入20μL5mol/LNaCl和120μL異丙醇,-20℃過夜。25000g離心15min,去上清,再次25000g離心5min,去上清,用TrisEDTA(pH7.5)緩沖液溶解沉淀。用20g/L瓊脂糖