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《基于inva基因的電化學(xué)dna傳感器的構(gòu)建及用于沙門氏菌快速高靈敏的檢測(cè)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、重慶醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文基于invA基因的電化學(xué)DNA傳感器的構(gòu)建及用于沙門氏菌快速高靈敏的檢測(cè)姓名：李青申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)教師：丁世家201205重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文基于砌糾基因的DNA電化學(xué)傳感器的構(gòu)建及用于快速高靈敏的檢測(cè)沙門氏菌宰摘要沙門氏菌，是世界范圍內(nèi)最常見的食源性致病菌之一，主要通過污染的動(dòng)物性食品(主要有肉類、家禽、蛋類和牛奶)傳播。致病-勝沙門菌主要引起人類和動(dòng)物的食物中毒、胃腸炎、傷寒和敗血癥等疾病，沙門氏菌不僅是公共衛(wèi)生健康的重大問題，還給部分
2、國(guó)家?guī)?lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，為有效地預(yù)防和控制疾病發(fā)生，建立一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)沙門氏菌的方法是非常必要的。電化學(xué)DNA傳感器以其靈敏度高，簡(jiǎn)單快速，選擇性好，成本低廉的顯著優(yōu)點(diǎn)而成為一種應(yīng)用廣泛的檢測(cè)手段。傳統(tǒng)檢測(cè)沙門氏菌的方法主要包括細(xì)菌培養(yǎng)，酶聯(lián)免疫分析(ELISA)和特異性聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(PCR)，但是均存一定的缺點(diǎn)，為克服沙門氏菌傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限性，本研究通過整合快速提取基因組DNA，PCR和構(gòu)建基于侵襲蛋白A(咖剛)基因的電化學(xué)DNA傳感器，發(fā)展了一種簡(jiǎn)單的檢測(cè)沙門氏菌的策
3、略，該策略能夠?qū)崿F(xiàn)簡(jiǎn)單、快速、靈敏的檢測(cè)沙門氏菌，為臨床診斷、食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域中致病性微生物的檢測(cè)提供了有力的工具。本研究主要包括以下三個(gè)部分：基于而謝基因的DNA電化學(xué)傳感器的構(gòu)建通過GeneBaIlk數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)致病性沙門菌特異性如倒基因設(shè)計(jì)‘基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21075l41)重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文靶序列和DNA探針，引物和探針特異性均用局部序列比對(duì)基本檢索工具(BLAST)比對(duì)證實(shí)其特異性。通過減少非特異性吸附引起的背景信號(hào)，結(jié)合鏈霉親和素．生物素耦合系統(tǒng)和
4、酶催化底物的作用放大電化學(xué)信號(hào)來(lái)提高傳感器的靈敏度。對(duì)電極表面的組裝和雜交過程進(jìn)行電化學(xué)阻抗(EIS)、方波伏安法(SwV)和表面等離子共振(SPR)表征，該傳感器對(duì)靶序列響應(yīng)的線性范圍為1pM．10nM，相關(guān)系數(shù)為0．9984，檢出限(LOD)達(dá)O．5pM。傳感器的高靈敏度主要是由于電極表面較低的非特異性吸附，生物素鏈霉親和素的結(jié)合能力及堿性磷酸酶強(qiáng)大的催化能力。通過檢測(cè)三種不同序列的核苷酸的電化學(xué)信號(hào)考察傳感器的特異性；同時(shí)考察兩個(gè)不同濃度5nM和100pM的靶序列的重現(xiàn)性，變異系數(shù)均小于5％。
5、本部分成功構(gòu)建了針對(duì)invA基因的靈敏度高、選擇性和重現(xiàn)性好的電化學(xué)DNA傳感器。電化學(xué)傳感器檢測(cè)沙門氏菌培養(yǎng)鼠傷寒沙門氏菌，用水煮破細(xì)胞法快速提取細(xì)菌基因組DNA，用特異性引物擴(kuò)增揚(yáng)講基因，作2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠電泳成像儀驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，結(jié)果表明，成功擴(kuò)增沙門氏菌砌剛基因靶序列，片段大小為284bp。提取不同濃度細(xì)菌的DNA模板，PCR擴(kuò)增后，將PCR產(chǎn)物加熱后冰浴變性獲得單鏈DNA，在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，電化學(xué)DNA傳感器對(duì)沙門菌的響應(yīng)范圍為10—105CFUmL一，靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它檢測(cè)
6、沙門氏菌的傳感器包括SPR傳感器，熒光傳感器，磁電傳感器，電容免疫傳感器，石英晶體微量天平，光纖傳感器及壓電免疫傳感器。整個(gè)檢測(cè)過程僅需要3．5h，本策略具有靈敏度4重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文高，操作方便快速，成本低的優(yōu)點(diǎn)，為醫(yī)：學(xué)疾病診斷，環(huán)境和食品衛(wèi)生中微生物的篩選和檢測(cè)提供了‘便利的平臺(tái)。關(guān)鍵詞：電化學(xué)生物傳感器；DNA檢測(cè)；PCR；沙門氏菌：初剛基因重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文RAPmANDSENSn’n砸STR．ATEGYFORSAI^虻)NEI，LA跚1rIoNUSINGAN眥GE
7、NE．BASEDELEClROCHEMⅢCALI撲tASENSORABSTRACT5：岔西曰D口(地asoneofthemostcommonpathogensoff-oodbomediseasewofldwide，generallyspreadsthrou曲theconsumptionofcont鋤inatedfoodofanimalori百n(mailllymeat，poul臼了，eggsandmilk)．PathogeIlic眥伽翎矗strainscausefoodpoisonillg，gas仃
8、oimestinalinflammation，夠phoidfeVer，andseptic鋤iainbomhumansanda11油als．Itconstitutesamajorpublichealthburdenandrepresentsasignificantcosti11maJlycoumries．Theref．ore，sensitiVeaJldrapiddetectionofSalmonellaisofout-mostimportancetopreVentand
