lamp快速檢測沙門菌inva基因的方法建立與應(yīng)用

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1、LAMP快速檢測沙門菌invA基因的方法建立與應(yīng)用【摘要】目的：建立一種環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loopmediatedisothermalamplification，LAMP)反應(yīng)快速檢測沙門菌的方法。方法：根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院基因序列數(shù)據(jù)庫(GenBank)上的鼠傷寒沙門菌的特異invA和fimA(登錄號：M90846和M18283)基因序列，設(shè)計特異引物，提取標(biāo)本DNA，然后以LAMP技術(shù)擴增invA基因，PCR方法擴增fimA基因，采用瓊脂糖電泳觀察結(jié)果。結(jié)果：91份血培養(yǎng)陽性報警瓶，LAMP和PCR法檢測出陽性18份，與最終培養(yǎng)結(jié)果一致

2、；30份糞便標(biāo)本，LAMP和PCR法檢測出陽性5份，培養(yǎng)陽性3份，LAMP測限達到102CFU／mL。結(jié)論：LAMP是一種簡便、快速、特異和敏感的檢測臨床和環(huán)境標(biāo)本中沙門菌的有效方法?！娟P(guān)鍵詞】沙門菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）核酸沙門菌(Salmotlella)是腸桿菌科中一種重要的人獸共患病病原菌，是引起傷寒、腸炎等多種疾病的重要病原菌。目前，對于沙門菌的檢測普遍采用培養(yǎng)、生化和血清學(xué)鑒定等方法，報告陽性結(jié)果至少需要3～5天，且較為繁瑣、費時費力。而酶聯(lián)免疫吸附試驗、肥達試驗、凝集試驗、免疫電泳、PCR等方法均存在對檢測標(biāo)準(zhǔn)的特殊要求以及特

3、異性方面的不理想等因素[1,2]。我們應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）反應(yīng)快速檢測沙門菌，報道如下。1材料與方法1.1試劑和儀器核酸擴增儀（MyGetleThermalCycler，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)，BstDNA聚合酶(NeA基因(GenBank登錄號：M90846和M18283)分別設(shè)計特異LAMP和PCR特異引物(上海生工合成)。1.4陽性血培養(yǎng)瓶中細菌DNA模板提取采取鹽酸胍苯甲醇法[3]：①從陽性血培養(yǎng)瓶中以無菌方式取100μl培養(yǎng)物置入1．5ml的EP管中，然后加入5M鹽酸胍緩沖液100μl，渦旋振蕩5min；②依次加入4

4、00μl雙蒸水和800μl苯甲醇，渦旋振蕩1min，然后在4℃下以700×g離心5min；③取上層水相約0.4ml到一新Ep管，依次加入3M醋酸鈉緩沖液40μl和異丙醇0．44ml，然后在4℃T16，000×g離心15min；④倒掉上層液體，加入1ml70％乙醇洗滌，然后在4℃T16，000×g離心10min，接著倒掉上層的乙醇，待自然干燥后加入100μl雙蒸水溶解管底的DNA沉淀備用。1.5糞便標(biāo)本細菌DNA直接提取按照3討論沙門菌的特異性引物基因一般分為屬特異性、血清群特異性和血清型特異性三類。目前多數(shù)研究人員都是使用屬特異性引物基因用以

5、檢測沙門菌，如invA和fimA等基因。Huguette[5]等證明了27個血清群中的80種血清型沙門菌均存在，fimA基因，具有相當(dāng)保守性。沙門菌invA基因是編碼吸附和侵襲上皮細胞的表面抗原，Boyd[6]等對invA基因多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，invA基因與看家基因有相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?。Boilaychuk[7]等用熒光定量方法檢測沙門菌invA基因，也發(fā)現(xiàn)其檢測效果與培養(yǎng)方法一致。本試驗中根據(jù)兩種基因所設(shè)計的引物序列，也得到了很好的特異性結(jié)果。LAMP技術(shù)是Notomi[8]等在2000年提出的一種新的核酸擴增技術(shù)，采用2對引物來識別目標(biāo)基因的6

6、個不同區(qū)段，通過鏈置換反應(yīng)和兩個環(huán)介導(dǎo)實現(xiàn)等溫條件下基因快速擴增，具有擴增反應(yīng)快(一般在1小時內(nèi)完成)、靈敏度高、特異性強、不需要昂貴的儀器(恒溫水浴鍋即可)等優(yōu)點，擴增產(chǎn)生的產(chǎn)物量大，形成白色的焦磷酸鎂鹽沉淀，結(jié)果的觀察也十分方便，甚至可用肉眼觀察產(chǎn)生濁度的反應(yīng)管即為陽性[9]。還可以加入SyberGreenI或者溴化乙錠等熒光染料，通過直接觀察熒光來判斷是否有擴增產(chǎn)物出現(xiàn)。目前，分子生物學(xué)方面的核酸擴增技術(shù)已經(jīng)非常成熟，但PCR檢測方法需要精密、昂貴的擴增儀器，且存在一些干擾檢測結(jié)果的因素，故未被應(yīng)用于廣大基層醫(yī)療和食品保健等單位。LAM

7、P方法與傳統(tǒng)方法相比雖然沒有明顯陽性率檢出優(yōu)勢，但有操作簡單、快速，特異性高等特點，因而此項技術(shù)值得基層醫(yī)療單位進一步推廣，也可作為基層防疫部門對飲食業(yè)環(huán)境以及食品安全監(jiān)測的快速初篩試驗，在流行病學(xué)上有重要意義。本研究中經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法確診的來自血培養(yǎng)18株沙門菌和糞便培養(yǎng)的3株沙門菌均可以通過LAMP和PCR方法擴增出來，并且兩種核酸擴增方法在糞便培養(yǎng)標(biāo)本中多檢測出2株沙門菌，這可能與分子生物學(xué)的高靈敏度以及培養(yǎng)時取材的量和位置有關(guān)。最終培養(yǎng)證實上述21株菌株分屬沙門菌AD群。但對于糞便標(biāo)本來說，值得注意的是部分沙門菌可以伴隨人體糞便而持續(xù)

8、分泌數(shù)月到數(shù)年之久，故對于檢出結(jié)果臨床上要慎重對待，不應(yīng)認為檢出沙門菌即要給予抗生素治療，而應(yīng)根據(jù)病人癥狀來判斷是否為沙門菌感染，或僅是攜帶者。有資料[10]顯示，