LAMP快速檢測沙門菌invA基因的方法建立與應用.doc

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1、LAMP快速檢測沙門菌invA基因的方法建立與應用【摘要】目的：建立一種環(huán)介導等溫擴增(loopmediatedisothermalamplification，LAMP)反應快速檢測沙門菌的方法。方法：根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院基因序列數(shù)據(jù)庫(GenBank)上的鼠傷寒沙門菌的特異invA和fimA(登錄號：M90846和M18283)基因序列，設計特異引物，提取標本DNA，然后以LAMP技術擴增invA基因，PCR方法擴增fimA基因，采用瓊脂糖電泳觀察結果。結果：91份血培養(yǎng)陽性報警瓶，LAMP和PCR法檢測出陽性18份，與最終培養(yǎng)結果一致；

2、30份糞便標本，LAMP和PCR法檢測出陽性5份，培養(yǎng)陽性3份，LAMP測限達到102CFU／mL。結論：LAMP是一種簡便、快速、特異和敏感的檢測臨床和環(huán)境標本中沙門菌的有效方法?！娟P鍵詞】沙門菌環(huán)介導等溫擴增（LAMP）核酸沙門菌(Salmotlella)是腸桿菌科中一種重要的人獸共患病病原菌，是引起傷寒、腸炎等多種疾病的重要病原菌。目前，對于沙門菌的檢測普遍采用培養(yǎng)、生化和血清學鑒定等方法，報告陽性結果至少需要3～5天，且較為繁瑣、費時費力。而酶聯(lián)免疫吸附試驗、肥達試驗、凝集試驗、免疫電泳、PCR等方法均存在對檢測標準的特殊要求以及特異性

3、方面的不理想等因素[1,2]。我們應用環(huán)介導等溫擴增（LAMP）反應快速檢測沙門菌，報道如下。1材料與方法1.1試劑和儀器核酸擴增儀（MyGetleThermalCycler，杭州朗基科學儀器有限公司)，BstDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs)，PCR試劑盒(Takara公司)，得靈Walkaway96全自動細菌鑒定儀，BacT/Alert全自動血培養(yǎng)儀及其配套的血培養(yǎng)瓶(法國生物梅里埃公司產(chǎn)品)。1.2標本和菌株來源91份陽性血培養(yǎng)瓶和30份糞便標本均來自溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院細菌室。鑒定特異性的參照菌株除標準ATCC菌株購

4、自衛(wèi)生部臨床檢驗中心，其它菌株均為溫州醫(yī)學院細菌室臨床鑒定菌株。1.3引物針對鼠傷寒沙門菌的invA和fimA基因(GenBank登錄號：M90846和M18283)分別設計特異LAMP和PCR特異引物(上海生工合成)。1.4陽性血培養(yǎng)瓶中細菌DNA模板提取采取鹽酸胍苯甲醇法[3]：①從陽性血培養(yǎng)瓶中以無菌方式取100μl培養(yǎng)物置入1．5ml的EP管中，然后加入5M鹽酸胍緩沖液100μl，渦旋振蕩5min；②依次加入400μl雙蒸水和800μl苯甲醇，渦旋振蕩1min，然后在4℃下以700×g離心5min；③取上層水相約0.4ml到一新Ep管

5、，依次加入3M醋酸鈉緩沖液40μl和異丙醇0．44ml，然后在4℃T16，000×g離心15min；④倒掉上層液體，加入1ml70％乙醇洗滌，然后在4℃4T16，000×g離心10min，接著倒掉上層的乙醇，待自然干燥后加入100μl雙蒸水溶解管底的DNA沉淀備用。1.5糞便標本細菌DNA直接提取按照文獻[4]進行。1.6綿羊血瓊脂平板上菌株的DNA提取挑取1個以上純菌落置入內(nèi)含100μl裂解液(蛋白酶K濃度為200ng／ml的0．5％NP40溶液)的0．5ml離心管內(nèi)，56℃水浴1小時，95℃水浴消化15min，然后14，000r／min，

6、離心30秒，上清液即為PCR擴增檢測的模板液。1.7標本檢測對陽性血培養(yǎng)瓶和糞便培養(yǎng)標本提取的細菌DNA進行LAMP和PCR檢測，并同時對上述標本進行傳統(tǒng)方法鑒定，根據(jù)沙門菌分型抗血清和生化鑒定結果確診沙門菌。LAMP反應體系(25μl)中包括1.6μmol／L的引物FIP和BIP,0.2μmol／L的引物F3和B3，1.2mmol／L的dNTP，4mmol／LMgSO4，1×thermopolbuffer(NewEnglandBiolabs)，0.8mol／Lbetaine和2.5μl的模板，反應條件為：先95℃5min，然后冰上冷卻，再加入

7、8UBstDNA聚合酶1μl，63℃恒溫1小時，最后80℃，3min終止反應。PCR反應體系(25μl)條件為：0.2mmol／L的dNTP、1．25U的Taq酶0．4μmol／L的正反向引物、1．5mmol／L的Mg2+和3．0μl的模板。反應條件為：先94℃2min，再按94℃1min→52℃30s→72℃1min，共30個循環(huán)；最后72℃10min。兩種方法產(chǎn)物分別在含溴化乙啶的2％瓊脂糖中電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果并照像。1.8特異性和最低檢測限分析將由參照菌株提取的DNA進行LAMP和PCR擴增，以檢測特異性；將臨床鑒定鼠傷寒沙門

8、菌接種于綿羊血瓊脂平板過夜培養(yǎng)，然后挑取菌落制備一系列濃度的菌懸液提取模板DNA，最后以LAMP和PCR擴增各濃度模板中的相應特異基因。2結果2.1臨