lamp快速檢測(cè)沙門(mén)菌inva基因的方法建立與應(yīng)用

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1、LAMP快速檢測(cè)沙門(mén)菌invA基因的方法建立與應(yīng)用【摘要】目的：建立一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loopmediatedisothermalamplification，LAMP)反應(yīng)快速檢測(cè)沙門(mén)菌的方法。方法：根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)上的鼠傷寒沙門(mén)菌的特異invA和fimA(登錄號(hào)：M90846和M18283)基因序列，設(shè)計(jì)特異引物，提取標(biāo)本DNA，然后以LAMP技術(shù)擴(kuò)增invA基因，PCR方法擴(kuò)增fimA基因，采用瓊脂糖電泳觀察結(jié)果。結(jié)果：91份血培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)警瓶，LAMP和PCR法檢測(cè)出陽(yáng)性18份，與最終培養(yǎng)結(jié)果一致

2、；30份糞便標(biāo)本，LAMP和PCR法檢測(cè)出陽(yáng)性5份，培養(yǎng)陽(yáng)性3份，LAMP測(cè)限達(dá)到102CFU／mL。結(jié)論：LAMP是一種簡(jiǎn)便、快速、特異和敏感的檢測(cè)臨床和環(huán)境標(biāo)本中沙門(mén)菌的有效方法。【關(guān)鍵詞】沙門(mén)菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）核酸沙門(mén)菌(Salmotlella)是腸桿菌科中一種重要的人獸共患病病原菌，是引起傷寒、腸炎等多種疾病的重要病原菌。目前，對(duì)于沙門(mén)菌的檢測(cè)普遍采用培養(yǎng)、生化和血清學(xué)鑒定等方法，報(bào)告陽(yáng)性結(jié)果至少需要3～5天，且較為繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、肥達(dá)試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)、免疫電泳、PCR等方法均存在對(duì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的特殊要求以及特

3、異性方面的不理想等因素[1,2]。我們應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）反應(yīng)快速檢測(cè)沙門(mén)菌，報(bào)道如下。1材料與方法1.1試劑和儀器核酸擴(kuò)增儀（MyGetleThermalCycler，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)，BstDNA聚合酶(NeA基因(GenBank登錄號(hào)：M90846和M18283)分別設(shè)計(jì)特異LAMP和PCR特異引物(上海生工合成)。1.4陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中細(xì)菌DNA模板提取采取鹽酸胍苯甲醇法[3]：①?gòu)年?yáng)性血培養(yǎng)瓶中以無(wú)菌方式取100μl培養(yǎng)物置入1．5ml的EP管中，然后加入5M鹽酸胍緩沖液100μl，渦旋振蕩5min；②依次加入4

4、00μl雙蒸水和800μl苯甲醇，渦旋振蕩1min，然后在4℃下以700×g離心5min；③取上層水相約0.4ml到一新Ep管，依次加入3M醋酸鈉緩沖液40μl和異丙醇0．44ml，然后在4℃T16，000×g離心15min；④倒掉上層液體，加入1ml70％乙醇洗滌，然后在4℃T16，000×g離心10min，接著倒掉上層的乙醇，待自然干燥后加入100μl雙蒸水溶解管底的DNA沉淀備用。1.5糞便標(biāo)本細(xì)菌DNA直接提取按照3討論沙門(mén)菌的特異性引物基因一般分為屬特異性、血清群特異性和血清型特異性三類(lèi)。目前多數(shù)研究人員都是使用屬特異性引物基因用以

5、檢測(cè)沙門(mén)菌，如invA和fimA等基因。Huguette[5]等證明了27個(gè)血清群中的80種血清型沙門(mén)菌均存在，fimA基因，具有相當(dāng)保守性。沙門(mén)菌invA基因是編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞的表面抗原，Boyd[6]等對(duì)invA基因多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，invA基因與看家基因有相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?。Boilaychuk[7]等用熒光定量方法檢測(cè)沙門(mén)菌invA基因，也發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)效果與培養(yǎng)方法一致。本試驗(yàn)中根據(jù)兩種基因所設(shè)計(jì)的引物序列，也得到了很好的特異性結(jié)果。LAMP技術(shù)是Notomi[8]等在2000年提出的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，采用2對(duì)引物來(lái)識(shí)別目標(biāo)基因的6

6、個(gè)不同區(qū)段，通過(guò)鏈置換反應(yīng)和兩個(gè)環(huán)介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)等溫條件下基因快速擴(kuò)增，具有擴(kuò)增反應(yīng)快(一般在1小時(shí)內(nèi)完成)、靈敏度高、特異性強(qiáng)、不需要昂貴的儀器(恒溫水浴鍋即可)等優(yōu)點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn)物量大，形成白色的焦磷酸鎂鹽沉淀，結(jié)果的觀察也十分方便，甚至可用肉眼觀察產(chǎn)生濁度的反應(yīng)管即為陽(yáng)性[9]。還可以加入SyberGreenI或者溴化乙錠等熒光染料，通過(guò)直接觀察熒光來(lái)判斷是否有擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。目前，分子生物學(xué)方面的核酸擴(kuò)增技術(shù)已經(jīng)非常成熟，但PCR檢測(cè)方法需要精密、昂貴的擴(kuò)增儀器，且存在一些干擾檢測(cè)結(jié)果的因素，故未被應(yīng)用于廣大基層醫(yī)療和食品保健等單位。LAM

7、P方法與傳統(tǒng)方法相比雖然沒(méi)有明顯陽(yáng)性率檢出優(yōu)勢(shì)，但有操作簡(jiǎn)單、快速，特異性高等特點(diǎn)，因而此項(xiàng)技術(shù)值得基層醫(yī)療單位進(jìn)一步推廣，也可作為基層防疫部門(mén)對(duì)飲食業(yè)環(huán)境以及食品安全監(jiān)測(cè)的快速初篩試驗(yàn)，在流行病學(xué)上有重要意義。本研究中經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法確診的來(lái)自血培養(yǎng)18株沙門(mén)菌和糞便培養(yǎng)的3株沙門(mén)菌均可以通過(guò)LAMP和PCR方法擴(kuò)增出來(lái)，并且兩種核酸擴(kuò)增方法在糞便培養(yǎng)標(biāo)本中多檢測(cè)出2株沙門(mén)菌，這可能與分子生物學(xué)的高靈敏度以及培養(yǎng)時(shí)取材的量和位置有關(guān)。最終培養(yǎng)證實(shí)上述21株菌株分屬沙門(mén)菌AD群。但對(duì)于糞便標(biāo)本來(lái)說(shuō)，值得注意的是部分沙門(mén)菌可以伴隨人體糞便而持續(xù)

8、分泌數(shù)月到數(shù)年之久，故對(duì)于檢出結(jié)果臨床上要慎重對(duì)待，不應(yīng)認(rèn)為檢出沙門(mén)菌即要給予抗生素治療，而應(yīng)根據(jù)病人癥狀來(lái)判斷是否為沙門(mén)菌感染，或僅是攜帶者。有資料[10]顯示，